趙紅果 郭寶芝 劉愛珍 宋芷霜 蔡海瑜 丁俊珊 劉路玖

宮頸癌是惡性腫瘤中的一大典型代表，屬于婦科范圍，在各種婦科惡性腫瘤中，它的發(fā)病率僅僅是低于乳腺癌的[1]。腺鱗癌、鱗癌、腺癌是其比較普遍的幾種病理類型，以下是與其發(fā)病原因有緊密聯(lián)系的幾點(diǎn)因素：①發(fā)揮協(xié)同作用的滴蟲等病原體的感染、沙眼衣原體、單純皰疹病毒Ⅱ型；②營食不健康，生活環(huán)境差；③感染啦高危型的HPV；葉酸有利于DNA修復(fù)和合成、癌細(xì)胞快速增殖分裂以及細(xì)胞代謝，癌細(xì)胞中的DNA合成能夠被高效分裂主要是依賴于葉酸，因此，近年來醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)聚焦到了轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸的葉酸受體α上。黏液腺癌中的FR-α能夠高表達(dá)，同時(shí)它也在子宮腺癌、宮睪丸絨和某些腦腫瘤中起作用。在增殖細(xì)胞核中Ki-67的是1種密切相關(guān)于細(xì)胞增殖的核蛋白，它在醫(yī)療界常被作為標(biāo)記物去評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖，Ki-67的這些特性，在研究腫瘤問題過程中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。我們?cè)诖舜窝芯繉m頸癌組織中Ki-67及FR-α蛋白的表達(dá)中用到了免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry)，探討二者的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 基本資料

選取2010年1月至2015年12月在本院因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)、因癌前病變行手術(shù)治療以及因?qū)m頸癌行手術(shù)治療的患者50例。其中15例宮頸癌組從在本院接受過宮頸癌手術(shù)的患者中選取(4例宮頸癌Ⅱ期、3例宮頸癌Ⅲ期、8例宮頸癌Ⅰ期)，17例正常宮頸組織組從在本院進(jìn)行過子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的患者中選取。18例宮頸上皮內(nèi)瘤變組從在本院治療過癌前病變的患者中選取，且這些患者都被證實(shí)為是其宮頸上皮內(nèi)的組織發(fā)生瘤變。以上選取的50例患者平均年齡不超過40歲，且無其他癌癥史以及與婦科相關(guān)的嚴(yán)重病癥。

1.2 納入及排放標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡18～80歲，宮頸癌組的患者接受過宮頸癌手術(shù)，正常宮頸組則需保證在術(shù)前檢查宮頸液基時(shí)結(jié)果正常。所有參與實(shí)驗(yàn)的患者知情并且同意此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：除宮頸癌外還患有其他危重病。

1.3 方法

1.3.1 葉酸受體α的表達(dá) 采用免疫組化PV法檢測(cè)樣本石蠟包埋、浸蠟、透明、脫水，將蠟塊切片到約4 μm時(shí)。染色采用免疫組織化學(xué)PV6001法,操作均按照pv法說明書執(zhí)行[4]。

1.3.2 Ki-67表達(dá) 采用免疫組化PV法檢測(cè)福爾馬林液可以有效的固定保存實(shí)驗(yàn)中的樣本，將蠟塊切片到約4 μm時(shí)。采用免疫組織化學(xué)PV6001法[5]。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 判斷FR-α蛋白在組織中陽性表達(dá) 當(dāng)棕黃色顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，F(xiàn)R-α蛋白在組織中呈陽性表達(dá)，切片強(qiáng)度判定均用雙盲法。細(xì)胞染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：淡黃色為1分，棕褐色為3分，棕黃色為2分，未見染色為0分；陽性細(xì)胞所占百分比標(biāo)準(zhǔn)如下： 5個(gè)高倍鏡下的視野，選定每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，80%～100%為4，10%～50%為2，0～1%為0，1%～10%為1，50%～80%為3。總評(píng)分=細(xì)胞染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞所占百分比得分，其判定結(jié)果如下：IHS 0分為(-)，IHS 1～4分為(+)，IHS 5～8分為(++)，IHS 9～12分為(+++)[6]。

1.4.2 判斷Ki-67在組織中陽性表達(dá) Ki-67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核中，切片強(qiáng)度判定均用雙盲法。評(píng)分細(xì)胞染色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)如下：淡黃色為1分，棕褐色為3分，棕黃色為2分，未見染色為0分。評(píng)分陽性細(xì)胞所占百分比的標(biāo)準(zhǔn)如下：任意觀察5個(gè)高倍鏡下的視野，選定每個(gè)視野中較清楚的100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)為80%～100%為4分，50%～80%為3，10%～50%為2分，1%～10%為1分，0～1%為0分。總評(píng)分=細(xì)胞染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞所占百分比得分，其判定結(jié)果如下：IHS 0分為(-)，IHS 1～4分為(+)，IHS 5～8分為(++)，IHS 9～12分為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，用Fish確切概率法計(jì)數(shù)資料，用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析者者這兩組結(jié)果變量的關(guān)系。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組中FR-α蛋白表達(dá)

FR-α 表達(dá)陽性率在18例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織為75.0%、15例宮頸癌組織為80.0%、17例正常宮頸組織6.7%，三組數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組織與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中FR-α陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，宮頸癌組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中FR-α 蛋白陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 FR-α蛋白在不同組織中的表達(dá)/例

2.2 三組組織中Ki-67蛋白表達(dá)

Ki-67蛋白表達(dá)陽性率18例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織為72.2%，15例宮頸癌組織為86.7%、17例正常宮頸組織為0.0%，三組數(shù)據(jù)比較得知，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，宮頸癌組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中 Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 Ki-67蛋白在不同組織中的表達(dá)情況/例

2.3 FR-α在不同臨床分期宮頸癌組織中的表達(dá)

FR-α蛋白表達(dá)陽性率8例宮頸癌Ⅰ期為65%，宮頸癌Ⅱ期為80%，宮頸癌Ⅲ期為67%，三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同分期宮頸癌組織中FR-α蛋白的表達(dá)情況/例

2.4 Ki-67在不同臨床分期宮頸癌組織中的表達(dá)

Ki-67蛋白陽性表達(dá)率宮頸癌Ⅰ期為75%，宮頸癌Ⅱ期為50%，宮頸癌Ⅲ期為100%，比較3組數(shù)據(jù)得知，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 Ki-67蛋白在不同時(shí)期宮頸上皮內(nèi)瘤變組中的表達(dá)/例

3 討論

宮頸癌是惡性腫瘤中的一大典型代表，屬于婦科范圍。每年死于宮頸癌的女性大約有二十萬。相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明人類乳頭瘤樣病毒(HPV)一旦侵入人體并且未得到有效清除，會(huì)導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病以及其后期的惡掠發(fā)展[7]。宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)(CINⅡ)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)(CINⅢ)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)(CINⅠ)為上皮內(nèi)病變的3種形式，病變加重時(shí)，浸潤性宮頸癌形成，宮頸癌Ⅱ期、宮頸癌Ⅲ期及宮頸癌Ⅳ期、宮頸癌Ⅰ期就是憑照瘤細(xì)胞浸潤的范圍來分類的[8-11]。如能盡早診斷出宮頸癌并立即進(jìn)行有效的治療，患者的生存率和生存質(zhì)量會(huì)大大提高。在臨床上主要是使用HPV分型、宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢(TCT)等，在多樣的方法中若能找出1種簡單、無創(chuàng)傷性、快捷、靈敏性及特異性高的方法，宮頸癌就能被更早發(fā)現(xiàn)，患者也就早日能進(jìn)行有效的治療，從而降低宮頸癌患者的死亡率。

宮頸癌的發(fā)生到發(fā)展再到惡化是1個(gè)復(fù)雜的過程，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程與葉酸受體有著重要的關(guān)系。葉酸受體主要分為FR-β、FR-γ，F(xiàn)R-α，Toffoli、Kall等的早年研究表明FR-α對(duì)卵巢腫瘤的早期診斷具有相當(dāng)高特異性的準(zhǔn)確的靈敏度。然而卻幾乎沒有報(bào)道是關(guān)于研究FR-α和診斷宮頸癌關(guān)系的。此次實(shí)驗(yàn)旨在通過研究宮頸癌中FR-α的表達(dá)，得到1種有利于預(yù)判宮頸癌是否發(fā)生的標(biāo)記物[12-15]。為了研究癌細(xì)胞增殖與FR-α的關(guān)系，需同時(shí)了解到宮頸癌中Ki-67的表達(dá)，位于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核核內(nèi)的Ki-67，被諸多醫(yī)學(xué)者的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠作為1種有效可靠的細(xì)胞增殖標(biāo)記物。Ki-67能夠較準(zhǔn)確的預(yù)判腫瘤的發(fā)展進(jìn)程以及良惡。 患者的治愈率和宮頸癌的后期發(fā)展也都與Ki-67在細(xì)胞核中的表達(dá)水平有密切關(guān)系。用免疫組化方法探究Ki-67和FR-α表達(dá)的相關(guān)性。宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、正常宮頸組織、宮頸癌組織中的FR-α蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，并以棕黃色顆粒的形狀呈現(xiàn)。宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、正常宮頸組織、宮頸癌組織中的Ki-67蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，并以棕黃色顆粒的形狀呈現(xiàn)。若想得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，可以增加樣本量以減少誤差。而通過其在正常樣本數(shù)內(nèi)的組之間的比較得知，Ki-67與FR-α有密切的關(guān)系，而Ki-67又是1種有效可靠的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，因此得出FR-α轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸與癌細(xì)胞分裂增殖有關(guān)系。

綜上所述，F(xiàn)R-α 蛋白表達(dá)升高與宮頸癌發(fā)病有關(guān)，F(xiàn)R-α 蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變織和宮頸癌中的表達(dá)與 Ki-67 有相關(guān)性。由此可得知FR-α 蛋白會(huì)在細(xì)胞增殖中起作用從而影響宮頸癌。