郝 飛

（河北省張家口市畜牧技術(shù)推廣站,河北 張家口 075000)

苜蓿是世界上栽培最早，分布面積最廣的一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，畜禽喜食等特點(diǎn)，苜蓿在國內(nèi)外種植面積不斷擴(kuò)大。然而苜蓿病害直接導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的損失和牧草品質(zhì)的降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。

對(duì)苜蓿病害有積極作用的酶類有多種，過氧化物酶、多酚氧化酶是其中很重要的兩種。過氧化物酶(簡稱POD)廣泛存在于植物中，其功能多種多樣，在植物不同生長發(fā)育時(shí)期和不同組織器官內(nèi)，過氧化物酶的活性有很大變化。關(guān)于多酚氧化酶(簡稱PPO)最早在1937年分離出來。目前對(duì)PPO生理功能的研究比較多的集中在它與植物抗病性關(guān)系上。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地自然概況

表1 供試材料情況

表2 苜蓿褐斑病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)地設(shè)在陜西省楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作一站，該站位于秦嶺北麓、渭河平原西部的頭道塬上，北緯34°21′,東經(jīng)108°10′，海拔454.8m，年均日照時(shí)間2150h，年均溫12～14℃,極端最高溫 40℃,極端最低溫 -21℃，年均降水量621.6mm,春季降水偏少、干旱，降水主要集中在7～9月，屬溫暖帶半濕潤氣候。土壤為黑壚土，土層深厚、通氣，有機(jī)質(zhì)1.59%，全氮0.055%。

1.2 供試材料

供試材料苜蓿共12個(gè)品種，其中中國材料4份，美國材料7份，德國材料1份，具體見表1。本實(shí)驗(yàn)材料分別在4月30日和5日1日兩次采集，采集時(shí)段為上午9：00～10；00。

1.3 方法

1.3.1 病害調(diào)查方法

選取12個(gè)苜蓿品種，分別在每個(gè)品種的小區(qū)內(nèi)隨機(jī)調(diào)查8個(gè)植株，觀察其褐斑病發(fā)病情況，并進(jìn)行數(shù)據(jù)紀(jì)錄，褐斑病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2。調(diào)查時(shí)間為4月29日。

苜蓿褐斑病癥狀：感病葉片出現(xiàn)褐色圓形小點(diǎn)狀的病斑，邊緣光滑或呈細(xì)齒狀,直徑0.5～2mm,互相多不匯合。后期病斑上出現(xiàn)淺褐色盤狀突起物,直徑約1mm。病原菌的子座和子囊盤多生于葉上面的病斑中。莖上病斑長形,黑褐色,邊緣整齊。病斑多半先發(fā)生于下部葉片和莖上,感病葉片很快變黃,脫落。

1.3.2 人工品種

2個(gè)品種均為2001年種植，小區(qū)試驗(yàn)，每小區(qū)18m2,重復(fù)3次。

1.3.3 酶液提取

稱取0.5g去中脈的苜蓿葉片，放入研缽中，加入5mL 1/15mol/L磷酸緩沖液pH7.8,冰研磨成勻漿，6000r/min離心20min，傾出上清液至5mL試管內(nèi)，剩余物加入少量緩沖液沖洗以后，再次離心（6000r/min，5min），傾出上清液至 5mL試管內(nèi)，如此重復(fù)3次，直到酶粗提液補(bǔ)足5mL，將酶液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 不同苜蓿品種抗褐斑病能力比較

表4 POD活性及方差分析

表5 PPO活性及方差分析

以上方法用于PPO酶液的提取，POD酶液提取使用的是0.01mol/L pH7.2磷酸緩沖液，其余方法同上。

1.3.4 酶活性測定：

過氧化物酶活性測定：采用愈創(chuàng)木酚做底物，用分光光度法測定生成物的含量。反應(yīng)液中含有1mL 0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.2，1mL0.1mol/L愈創(chuàng)木酚，1mL0.18%的H2O2，并加入適量的酶液后在30℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入5%偏磷酸0.1mL，終止反應(yīng)，在470nm下測定吸光值，以1mL去離子水代替H2O2為對(duì)照，在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘每克鮮重OD變化1.00所需的酶量為一個(gè)酶活單位。各樣品均重復(fù)測定3次。

多酚氧化酶活性測定：在小試管中依次加入1mL 1/15mol/L磷酸緩沖液pH6.8，1.5mL 0.02mol鄰苯二酚及適量的酶粗提液混合均勻后，放入40℃水浴鍋中保溫30min，在525nm波長下測定光密度，以磷酸緩沖液代替酶液做對(duì)照，在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘每克鮮重OD變化0.01所需的酶量為一個(gè)酶活單位。各樣品均重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿病害田間調(diào)查結(jié)果

田間調(diào)查12個(gè)苜蓿品種對(duì)苜蓿主要病害褐斑病的感染情況見表3。國內(nèi)外苜蓿品種均感染褐斑病。路德病情指數(shù)最低僅為0.10225，比平均值低96.34%，路寶為0.35503，其次為北疆苜蓿、射手、愛林+Z、愛菲尼特。德國大葉熊病情指數(shù)最高為10.1648，比路德高98.4倍，保豐苜蓿為9.61282。其次為中苜1號(hào)、美國雜交熊1號(hào)、中蘭1號(hào)、牧歌。

不同苜蓿品種發(fā)病率與病情指數(shù)基本呈一致趨勢，結(jié)合兩個(gè)指標(biāo)可較好反映苜蓿不同品種抗褐斑病的能力。綜合分析，路德、路寶、北疆苜蓿、射手、愛林+Z、愛菲尼特發(fā)病率低，病情指數(shù)較小，對(duì)褐斑病抵抗力較強(qiáng)。而德國大葉熊、保豐苜蓿、中苜1號(hào)、美國雜交熊1號(hào)、中蘭1號(hào)、牧歌發(fā)病率均高于1%，病情指數(shù)較高，抗褐斑病能力較差。

2.1 不同苜蓿品種POD活性

根據(jù)表4得知，路德的POD活性與牧歌、中蘭1號(hào)、美國雜交熊1號(hào)、中苜1號(hào)、保豐苜蓿、德國大葉熊差異極顯著，與愛菲尼特差異顯著；路寶的POD活性與中苜1號(hào)、保豐苜蓿、德國大葉熊差異極顯著，與中蘭1號(hào)、美國雜交熊1號(hào)差異顯著；北疆苜蓿、射手、愛林+Z、愛菲尼特的POD活性與保豐苜蓿、德國大葉熊差異極顯著，其中，北疆苜蓿、射手與美國雜交熊1號(hào)、中苜1號(hào)差異顯著，愛林+Z與中苜1號(hào)差異顯著。

2.3 不同苜蓿品種PPO活性

根據(jù)表5得知，路德的PPO活性與德國大葉熊差異極顯著，與保豐苜蓿差異顯著；路寶的PPO活性與德國大葉熊差異顯著；其他苜蓿品種差異不顯著。

2.4 POD、PPO與病情指數(shù)關(guān)系

從圖1，2，3可以看出總趨勢上，POD、PPO活性大小與苜蓿褐斑病發(fā)病表現(xiàn)具有一致性，可見，苜蓿植株內(nèi)的POD、PPO對(duì)其抗褐斑病性有著積極的作用，POD、PPO活性越高，抵抗褐斑病害能力越強(qiáng)，活性越低，抵抗能力越差。

3 結(jié)論

3.1 苜蓿過氧化物酶、多酚氧化酶對(duì)其抗褐斑病有著積極的作用，表現(xiàn)為酶活性越高，抵抗褐斑病能力越強(qiáng)；反之，抵抗能力越差。

圖1 不同苜蓿品種病情指數(shù)

圖2 不同苜蓿品種POD活性

3.2 苜蓿氧化物酶、多酚氧化酶與抗褐斑病關(guān)系，表現(xiàn)為總趨勢上變化的一致性，各苜蓿品種隨著酶活性的增大，表現(xiàn)為抗褐斑病能力的提高。但是，具體數(shù)據(jù)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系還未有定論。

3.3 12個(gè)苜蓿品種在抗病能力方面可分為兩類，高抗褐斑病型：路德、路寶、北疆苜蓿、射手；中抗褐斑病型：愛林+Z、愛菲尼特、牧歌、中蘭1號(hào)；低抗褐斑病型：美國雜交熊1號(hào)、中苜1號(hào)、保豐苜蓿、德國大葉熊。在高抗褐斑病型中，路德、路寶2個(gè)品種抗病能力表現(xiàn)最為明顯，在苜蓿病害嚴(yán)重的地區(qū)可試種。