，

缺血性腦卒中因其高死亡率、致殘率，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。腦組織缺血后腫脹壞死，壞死組織周邊的缺血半暗帶若能及早提供有效血供，可阻止缺血半暗帶進(jìn)一步向缺血壞死轉(zhuǎn)變[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針刺激可促進(jìn)缺血腦區(qū)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的表達(dá)，對腦缺血后的血管再生發(fā)揮顯著作用[2-3]。正常生理條件下，內(nèi)源性EPCs主要存在于骨髓，有研究表明，缺血性腦卒中發(fā)生后EPCs可經(jīng)骨髓動員至外周血，并進(jìn)一步歸巢至缺血區(qū)參與血管再生[4]。缺血性腦卒中發(fā)生后，有效動員骨髓中EPCs至外周血是內(nèi)源性EPCs參與缺血腦區(qū)血管再生的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)缺乏或被阻斷后，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)等誘導(dǎo)的EPCs動員能力顯著降低[5-6]。本研究探討電針刺激促進(jìn)內(nèi)源性EPCs動員至外周血的機(jī)制是否通過介導(dǎo)eNOS的表達(dá)實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級成年雄性SD大鼠60只，體重250 g～300 g。實驗動物由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、模型組(I/R組)、模型+電針組(I/RE組)、模型+電針+eNOS抑制劑(L-NAME)組(I/REL組)，再灌注1.5 h后各組又分為24 h、48 h、72 h 3個亞組，每個亞組5只大鼠。

1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠CD34抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，異硫氰酸(FITC)熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自博士德生物公司，紅細(xì)胞裂解液等購自灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海滬尚生物科技有限公司，L-NAME購自北京碧云天公司。

1.3 動物模型制備 根據(jù)本課題組前期經(jīng)驗制備局灶腦缺血/再灌注大鼠模型[3]，缺血時間為1.5 h。根據(jù)Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)[7]，待大鼠完全清醒后評分，以評分2分、3分為納入標(biāo)準(zhǔn)。蛛網(wǎng)膜下腔出血、HE染色無缺血病理改變及未觀察到、死亡大鼠不納入實驗，通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊大鼠數(shù)量。

1.4 電針刺激方法及腹腔給藥 針刺方法：取華佗牌不銹鋼銀針(直徑為0.38 mm，長度為1寸)5根，一根斜刺“百會”穴(GV 20)；兩根直刺左側(cè)“合谷”穴(合谷LI 4)，間距約2 mm；兩根直刺左側(cè)“太沖”穴(LR 3)，間距約2 mm。針刺頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，每日1次，每次20 min，強(qiáng)度以大鼠左側(cè)肢體輕微顫動為宜。腹腔注射L-NAME：造模成功后，立即給予藥物抑制組大鼠腹腔注射L-NAME，注射濃度為8 mg/kg，配藥濃度為8 mg/mL (即每8 mg的L-NAME溶于1 mL生理鹽水)[8]。

1.5 取樣及檢測

1.5.1 取材 每組取5只大鼠，使用真空促凝管抽取腹主動脈血2 mL，4 ℃靜置2 h，以3 000 r/min離心15 min，小心抽取上清液(即血清)-80 ℃保存供ELISA檢測使用；抽取腹主動脈血約2 mL，流式細(xì)胞學(xué)檢測備用；預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)分離雙側(cè)后肢骨腔中骨髓細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量1×106～1×107，流式細(xì)胞學(xué)檢測備用。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血及骨髓EPCs數(shù)量(EPCs占單核細(xì)胞數(shù)量的百分比) 取外周血及骨髓細(xì)胞懸液各100 μL，分別加入4 μL小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體避光孵育30 min，繼而加入2 mL紅細(xì)胞裂解液避光孵育5 min，4 ℃ 1 500 r/min離心5 min，棄上清，2 mL PBS重懸離心洗滌2次之后，加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗避光孵育30 min，PBS 2 mL重懸離心洗滌之后用PBS 100 μL重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測EPCs數(shù)量。

1.5.3 血清eNOS蛋白濃度 提前備好血清，采用ELISA法分別檢測外周血中eNOS蛋白表達(dá)，每個樣本3個復(fù)孔。樣本濃度與OD值呈正比，將標(biāo)準(zhǔn)品eNOS蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，各濃度在酶標(biāo)儀上450 nm檢測的吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將樣品吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，從而得到未知樣品eNOS的蛋白濃度。

2 結(jié) 果

2.1 外周血CD34+EPCs數(shù)量比較 I/R組大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后24 h、48 h、72 h外周血CD34+EPCs數(shù)量明顯高于S組(P<0.01)；I/RE組各時間點(diǎn)與I/R組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而I/REL組CD34+EPCs數(shù)量較I/RE組顯著降低(P<0.01)?？梢婋娽槍ν庵苎狤PCs的上調(diào)作用，在eNOS被抑制后降低。詳見圖1。

a為術(shù)后24 h S組；b為術(shù)后24 h I/R組；c為術(shù)后24 h I/RE組；d為術(shù)后24 h I/REL組；e為術(shù)后48 h S組；f為術(shù)后48 h I/R組；g為術(shù)后48 h I/RE組；h為術(shù)后48 h I/REL組；i為術(shù)后72 h S組；j為術(shù)后72 h I/R組；k為術(shù)后72 h I/RE組；l為術(shù)后72 h I/REL組。與S組比較，*P<0.01，與I/R組比較；#P<0.01；與I/REL組比較，△P<0.01。

各組大鼠外周血CD34+EPCs數(shù)量比較

2.2 骨髓CD34+EPCs數(shù)量變化情況 研究結(jié)果顯示，大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后24 h、48 h、72 h骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量逐漸降低，但均明顯高于同時間點(diǎn)S組(P<0.01)；I/RE組各時間點(diǎn)與I/R組比較均顯著增高(P<0.01)；eNOS抑制劑抑制后骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量較I/RE組顯著降低(P<0.01)。表明電針或可通過介導(dǎo)eNOS促進(jìn)大鼠骨髓腔內(nèi)CD34+EPCs動員。詳見圖2。

a為術(shù)后24 h S組；b為術(shù)后24 h I/R組；c為術(shù)后24 h I/RE組；d為術(shù)后24 h I/REL組；e為術(shù)后48 h S組；f為術(shù)后48 h I/R組；g為術(shù)后48 h I/RE組；h為術(shù)后48 h I/REL組；i為術(shù)后72 h S組；j為術(shù)后72 h I/R組；k為術(shù)后72 h I/RE組；l為術(shù)后72 h I/REL組。與S組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與I/REL組比較，△P<0.01。

圖2各組大鼠骨髓CD34+EPCs數(shù)量比較

2.3 外周血eNOS蛋白濃度表達(dá)比較 I/R組大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后24 h、48 h、72 h外周血eNOS蛋白表達(dá)量明顯高于S組(P<0.01)；I/RE組各時間點(diǎn)與I/R組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而

I/REL組eNOS蛋白表達(dá)量相較I/RE組顯著降低(P<0.01)。表明電針可能通過調(diào)節(jié)eNOS表達(dá)促進(jìn)EPCs動員。詳見圖3。

與N組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與I/REL組比較，△P<0.01。

圖3各組大鼠血清eNOS蛋白表達(dá)比較

3 討 論

缺血性腦血管病在中醫(yī)學(xué)中以中風(fēng)病論治，此病病因復(fù)雜，治療周期長，不易康復(fù)。有關(guān)電針治療缺血性腦血管病的臨床及實驗研究表明，電針治療缺血性腦血管病具有良好的療效。馬璟曦等[9]發(fā)現(xiàn)針刺腦缺血/再灌注大鼠雙側(cè)“合谷”穴可促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注后CD34表達(dá)，增加新生血管密度，促進(jìn)血管新生。樊云等[10]對腦缺血/再灌注大鼠行電針療法，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)缺血腦區(qū)的血管新生。關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，電針可有效促進(jìn)內(nèi)源性EPCs的表達(dá)，EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員至外周血參與損傷血管的修復(fù)[11]。內(nèi)源性EPCs的動員是一個復(fù)雜過程，多種因子參與內(nèi)源性EPCs的動員，其中eNOS激活是EPCs動員不可缺少的因子之一。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物促進(jìn)外周血EPCs數(shù)量增加，eNOS缺乏上述作用被抑制，eNOS可調(diào)控EPCs動員。本研究探討電針對EPCs的動員作用是否通過對eNOS調(diào)控實現(xiàn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針可促進(jìn)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血CD34+EPCs數(shù)量，其中骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量隨大鼠缺血時間延長逐漸減少，外周血CD34+EPCs數(shù)量逐漸增多。從這一變化趨勢中，推測可能與CD34+EPCs在機(jī)體內(nèi)由骨髓內(nèi)動員至外周血有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)電針可上調(diào)eNOS的表達(dá)，電針可上調(diào)大鼠骨髓、外周血CD34+EPCs作用，eNOS被阻斷后受到抑制。因此，推斷電針或可通過介導(dǎo)eNOS表達(dá)刺激骨髓EPCs活化，并進(jìn)一步促進(jìn)局灶腦缺血后骨髓EPCs動員至外周血。

目前腦缺血的常規(guī)治療手段即為溶栓治療，但由于時間窗的限制，只有少數(shù)病人得到有效救治。故如何調(diào)動機(jī)體自身強(qiáng)大的自我修復(fù)能力，參與缺血性腦卒中后的血管再生及神經(jīng)再生日益成為目前研究重點(diǎn)。有研究表明，促進(jìn)缺血后血管再生可同時促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[13-14]，故腦缺血后的血管再生研究具有重要意義。本研究從機(jī)制上闡述缺血性腦卒中發(fā)生后機(jī)體可加強(qiáng)內(nèi)源性EPCs的表達(dá)，尤其在電針刺激下，內(nèi)源性EPCs的表達(dá)大幅提高，而電針對內(nèi)源性EPCs的調(diào)動作用可因eNOS的阻斷而減弱。本研究為電針治療缺血性腦卒中提供了分子靶點(diǎn)，今后將探討電針調(diào)動內(nèi)源性EPCs促進(jìn)缺血腦區(qū)血管的再生，為電針治療缺血性腦卒中提供理論基礎(chǔ)。