許金根, 蔡治華, 王立克

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

CD4蛋白為CD4+T細胞表面的標志物，是動物機體中的一種重要免疫分子。CD4主要表達于輔助性T細胞，通過識別MHCⅡ類分子結合的抗原而參與免疫應答[1-2]。CD4是研究動物免疫性狀的重要功能候選基因，已報道CD4序列遺傳變異與畜禽的疾病或免疫性狀相關。比如，CD4基因甲基化程度與奶牛的乳房炎相關[3]，而CD4基因變異與小型豬的血清IgG濃度相關[4]。選擇性剪接是真核生物基因一個前體mRNA通過不同剪接方式產(chǎn)生多個剪接異構體，從而表達具有不同生物學功能的蛋白質(zhì)，是形成生物多樣性的一種重要方式[5]。研究表明，動物體的CD4基因存在選擇性剪接現(xiàn)象。在小型豬中發(fā)現(xiàn)兩種CD4分子，但兩種CD4類型豬的CD3+和CD8+細胞數(shù)以及血清IgG和IgM濃度都沒有顯著差異[6]。另外，本人已在大白豬血液和組織中檢測到兩種相差外顯子8(長122 bp)的CD4 mRNA序列，導致兩者編碼的CD4蛋白相差60個氨基酸[7]。但這種CD4基因整個外顯子8缺失現(xiàn)象，尚未在奶牛等其他畜禽研究中報道。

基于前期在豬CD4基因外顯子8處檢測到的選擇性剪接體。因此，本試驗利用反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)和測序，檢測奶牛CD4基因外顯子8處的剪接體，為研究奶牛CD4基因的結構和功能提供相應基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集1頭成年荷斯坦奶牛3 mL尾靜脈血，立即加入9 mL RNAfixer保護劑(北京百泰克生物技術有限公司)充分混合，靜置10 min后于-70 ℃保存。用RNA提取試劑盒(QIAGEN凱杰生物技術有限公司)提取血液總RNA，經(jīng)NanoDrop核酸分析儀測定其濃度和純度，質(zhì)檢合格后(OD260/280在1.8～2.0，OD260/230>1.8)，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2 引物設計

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫普通牛(Bos taurus) CD4基因序列(ENSBTAG00000003255)，并結合NCBI牛CD4 mRNA序列(GenBank: AB674571.1)，通過序列比對區(qū)分出牛CD4基因各外顯子的位置。用Primer 5.0軟件在牛CD4基因的外顯子8兩側設計一對引物(表1)，用RT-PCR擴增和鑒定CD4外顯子8處的剪接體。

表1 牛CD4基因擴增引物

1.3 RT-PCR擴增和測序

以奶牛血液cDNA為模板，用引物擴增CD4基因外顯子8兩側序列。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。將PCR產(chǎn)物送至北京三博遠志生物技術有限責任公司測序，用DNAMAN軟件比對序列，并用Chromas軟件查看測序峰圖。

1.4 序列分析

通過在線序列比對(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)，比較分析不同CD4剪接體序列，并尋找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。

2 結果與分析

2.1 奶牛CD4基因剪接體鑒定

用RT-PCR在奶牛CD4基因外顯子8處檢測到兩種剪接體，與預期擴增長度542和420 bp一致，分別命名為CD4-1和CD4-2，且CD4-1在血液中的表達量高于CD4-2(圖1)。

圖1 牛CD4基因外顯子8處剪接體擴增

2.2 奶牛CD4基因擴增序列分析

通過與GenBank (AB 674571.1)公布的普通牛CD4序列比對，發(fā)現(xiàn)本試驗擴增的CD4-1序列(去除兩端測序較差序列)與其高度一致(圖2a)，表明擴增的是牛CD4基因部分mRNA序列。另外，通過測序，在CD4基因外顯子8的第64位，檢測到1個SNP (C/A變異) (圖2b)。

圖2 牛CD4基因外顯子8處序列分析

2.3 兩種奶牛CD4剪接體序列分析

通過序列比對分析(去除兩端測序較差序列)，發(fā)現(xiàn)擴增的牛CD4-1和CD4-2序列長度相差122 bp (圖3)，為整個外顯子8缺失。

3 結論與討論

前期研究結果表明，豬CD4 mRNA發(fā)現(xiàn)存在兩種相差122 bp(缺失整個外顯子8)的序列，兩者編碼的蛋白質(zhì)相差60個氨基酸(GenBank: KC 333253和KC 333254)[7]。本研究利用RT-PCR和測序，在奶牛血液中檢測到兩種相差122 bp(缺失外顯子8)的CD4 mRNA序列，且剪接型CD4表達量較低。GenBank數(shù)據(jù)庫(ID: AB 674571.1和NM 001103225.1)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(ID: ENSBTAT00000037742.4和ENSBTAT00000004219.4)都公布有兩種牛CD4 mRNA序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn)短的編碼區(qū)也是缺失長122 bp的外顯子8，導致兩者編碼的蛋白質(zhì)相差60個氨基酸，表明牛CD4基因外顯子8處存在選擇性剪接現(xiàn)象。

圖3 牛CD4基因外顯子8處兩種剪接體序列分析

此外，通過Ensembl數(shù)據(jù)庫檢索其他物種CD4基因mRNA序列，發(fā)現(xiàn)人(ENST 00000011653.8)、綿羊(ENSOART 00000006854.1) CD4基因的第8外顯子都是長122 bp，但是否也存在缺失整個外顯子8的現(xiàn)象仍需驗證。已有報道，利用單克隆抗體CC26鑒定出牛CD4蛋白存在不同的異構體[8]。鑒于CD4蛋白是維持和發(fā)揮CD4+ T細胞免疫功能的重要分子，故表達不同CD4蛋白的個體間免疫應答能力可能存在差異。本試驗初步發(fā)現(xiàn)了牛CD4基因外顯子8缺失，但剪接型CD4蛋白在機體中的生理功能有待進一步的研究。

綜上所述，本試驗發(fā)現(xiàn)牛CD4基因外顯子8存在缺失，并檢測到外顯子8有一個SNP，為研究CD4基因的結構和功能奠定一定基礎。