陳杰，王莉，王俊嶺，王慧

周口市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 周口4660000

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居所有女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌。近年來(lái)的調(diào)查顯示，宮頸癌的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢(shì)，對(duì)女性的健康造成嚴(yán)重的威脅[1]。宮頸癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未統(tǒng)一，近年來(lái)以腫瘤血管作為切入點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行生物靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)，其中表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的靶向藥物研究較多[2]。研究顯示，EGFR和VEGF在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡及細(xì)胞周期和血管生成等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默HeLa細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2（cyclo-oxygen-ase，COX-2）基因的表達(dá)，分析HeLa細(xì)胞中EGFR和VEGF的基因及蛋白表達(dá)水平，旨在為宮頸癌的治療提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞研究所。胎牛血清和0.25%胰酶溶液均購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；雙抗（青霉素與鏈霉素）溶液、TBST溶液、DHanks溶液、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NIH3T3培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液（horseradish peroxidase，PBS）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；鼠抗人COX-2、VEGF、EGFR單抗以及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；人COX-2siRNA、陰性對(duì)照siRNA均購(gòu)自西寶生物科技（上海）股份有限公司。LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；2×SYBR Mix和RT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-red公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Beckman公司；Transwell小室以及半透明8 μm聚碳酸濾膜均購(gòu)自德國(guó)Greiner公司；凝膠成像儀、PCR儀及電轉(zhuǎn)儀均購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)

從-80℃超低溫冰箱中取出凍存的HeLa細(xì)胞，室溫下融化3 min后，加入含10%胎牛血清、50 U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一日更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，加入0.25%胰酶消化1 min，隨后加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后，置于離心機(jī)中1000 r/min離心10 min，加入DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3代可用于后續(xù)研究。

1.3 COX- 2 siRNA轉(zhuǎn)染

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，加入0.25%胰酶溶液進(jìn)行消化，置于離心機(jī)中，1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/L，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%時(shí)，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。用DMEM培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞培養(yǎng)板，將已凋亡細(xì)胞去除，將7.5 μlCOX-2siRNA質(zhì)粒（上游序列為5'-GGACUUAUGGGUAAUGUUA-3'，下游序列為5'-CCUGAAUACCCAUUACAAU-3'）和5 μl LipofectamineTM2000與DMEM培養(yǎng)液混勻作為轉(zhuǎn)染組，室溫下放置5 min，隨后將兩者混勻，室溫下放置20 min為轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，隨后再加入培養(yǎng)液定容至2 ml，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，每組6個(gè)重復(fù)，空白對(duì)照組中僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組中加入陰性對(duì)照siRNA，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)VEGF和EGFR基因的表達(dá)水平

應(yīng)用RNA提取試劑盒提取HeLa細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。VEGF上游序列為5'-AGCACGAGCTACCTCAG-3'，下游序列為5'-TTTAGACATGCATGCATCGGCAGGAA-3'；EGFR上游序列為5'-AGATAGTCGCCCAAAGTTCCG-3'，下游序列為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；COX-2上 游 序 列 為 5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3'，下 游序列為5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，上游序列為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游序列為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。 反 應(yīng) 體 系 ：10 μl 2 ×SYBR Green Mix，上下游引物各 1 μl，ddH2O 8 μl，10×cDNA模板1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。利用CFX manager 3.0軟件進(jìn)行Cq值分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCq法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè)VEGF和EGFR蛋白表達(dá)水平

采用D-Hanks溶液清洗細(xì)胞，加入蛋白裂解液在冰上裂解30 min，置于離心機(jī)中，1200 r/min離心10 min，收集上清液，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，隨后制備8%分離膠和12.5%濃縮膠，蛋白上樣量統(tǒng)一為30 μg，起始電壓設(shè)置為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為120 V，反應(yīng)結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃冰浴，電壓設(shè)置為100 V，進(jìn)行1 h轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入TBST溶液進(jìn)行清洗后，加入5%脫脂牛奶，37℃封閉1 h，清洗PVDF膜，每次10 min，共3次。加入一抗稀釋液（COX-2、VEGF、EGFR），4℃振蕩過(guò)夜，加入PBS溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液（HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體），室溫下孵育2 h，PBS清洗后采用凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)水平。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后棄去原培養(yǎng)基，添加100 μl DMEM 溶液和 10 μl MTT 溶液 ，避光孵育4 h，棄去培養(yǎng)液后添加150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況

細(xì)胞中加入0.25%胰酶進(jìn)行消化，置于離心機(jī)中，1000 r/min離心10 min，收集下層細(xì)胞，加入含有10 μg/ml PI的 PBS 溶液 100 μl，重懸細(xì)胞后，在黑暗條件下染色30 min，采用細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.8 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力

采用24孔Transwell小室對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行評(píng)估，在小室下方加入NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液作為趨化因子，并將小室插件如濾膜、底板等于小室下方固定好，在小室上方加入已培養(yǎng)24 h的3組細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，將Transwell小室在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，將濾膜取出后，用棉簽去除未遷移的細(xì)胞，在室溫下加入70%甲醇固定40 min，采用蘇木精染色，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)穿膜的細(xì)胞數(shù)目，采用Image Pro Plus 6軟件分析細(xì)胞穿透率，細(xì)胞穿透率=穿膜數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX- 2、VEGF、EGFR基因表達(dá)水平的比較

RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的COX-2、VEGF、EGFR基因表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 3組HeLa細(xì)胞中COX- 2、VEGF、EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量

2.2 COX- 2、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組的COX-2、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.399，P﹤0.01；F=51.649，P﹤0.01；F=51.765，P﹤0.01）；轉(zhuǎn)染組的COX-2、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖2、表1）

圖2 Western blot結(jié)果圖

表1 3組HeLa細(xì)胞的COX- 2、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)水平（±s）

表1 3組HeLa細(xì)胞的COX- 2、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)水平（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別COX-2VEGF EGFR空白對(duì)照組陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染組0.82±0.16 1.04±0.21 0.24±0.08a b 0.85±0.11 1.07±0.19 0.32±0.06a b 0.78±0.15 0.92±0.18 0.17±0.02a b

2.3 細(xì)胞增殖抑制率的比較

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 3組HeLa細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表2 3組HeLa細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別12 h 24 h 48 h 72 h

2.4 細(xì)胞凋亡率的比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為（31.08±4.03）%，高于空白對(duì)照組的（8.36±0.73）%和陰性對(duì)照組的（8.98±0.95）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖3）

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HeLa細(xì)胞的凋亡情況

2.5 細(xì)胞穿透率的比較

Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿透率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.003，P﹤0.01）?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞穿透率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿透率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 3組HeLa細(xì)胞穿透率的比較（%，±s）

表3 3組HeLa細(xì)胞穿透率的比較（%，±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞穿透率

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展較為復(fù)雜，至少涉及2種癌變基因相互協(xié)同發(fā)揮作用，共同促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生癌變。COX-2是機(jī)體前列腺素生成的關(guān)鍵限速酶，研究表明，COX-2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明，宮頸癌細(xì)胞中的COX-2能通過(guò)促進(jìn)VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管形成，實(shí)現(xiàn)腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[5]。此外還有研究顯示，EGFR可通過(guò)與含表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）的類纖維蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 1（EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）結(jié)合，激活MAPK-VEGF信號(hào)通路，從而促進(jìn)宮頸癌微血管生成[6]。因此，VEGF和EGFR可能為控制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)，如何降低VEGF和EGFR的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是目前的研究熱點(diǎn)。

COX-2屬于誘導(dǎo)酶，在正常組織中一般不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到促癌劑、炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子等的刺激后會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)，其主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控[7]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤血管形成，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。另有研究顯示，COX-2在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)異常升高，免疫組化染色結(jié)果說(shuō)明COX-2主要在瘤變上皮細(xì)胞及惡性上皮細(xì)胞中表達(dá)，提示COX-2可能參與宮頸癌的發(fā)生[9-10]。此外還有研究顯示，COX-2表達(dá)水平在淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者中明顯升高，表明COX-2與宮頸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，且腫瘤復(fù)發(fā)患者中COX-2的表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)患者，提示COX-2與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的COX-2、VEGF、EGFR基因表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，細(xì)胞穿膜率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。提示COX-2過(guò)表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡中具有重要意義。

VEGF在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，尤其在胚胎發(fā)育時(shí)期高度表達(dá)，較多研究均證實(shí)VEGF表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[12-13]。有研究報(bào)道，宮頸癌細(xì)胞中COX-2與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)[14]。相關(guān)學(xué)者將COX-2基因轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞中，進(jìn)而誘導(dǎo)COX-2基因過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示VEGF表達(dá)水平明顯升高，當(dāng)抑制COX-2基因表達(dá)時(shí)，VEGF基因的表達(dá)也受到抑制，提示COX-2基因能夠調(diào)控VEGF基因表達(dá)[15]。研究顯示，在乳腺癌以及大腸癌細(xì)胞中COX-2基因可以通過(guò)中間蛋白CCR-7調(diào)控VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成，提示兩者在腫瘤細(xì)胞的形成中存在相互交叉的作用[16]。Deshpande等[17]研究顯示，在頭頸鱗癌細(xì)胞中COX-2過(guò)表達(dá)能夠刺激VEGF的上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)淋巴血管生成。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中VEGF均呈高表達(dá)，而轉(zhuǎn)染COX-2siRNA后，VEGF的基因與蛋白表達(dá)水平均降低，且細(xì)胞穿膜率降低，增殖抑制率升高，表明siRNA干擾HeLa細(xì)胞中COX-2基因的表達(dá)后，COX-2基因表達(dá)水平降低，VEGF基因表達(dá)水平也降低，提示COX-2沉默后可能通過(guò)抑制VEGF的合成，抑制細(xì)胞遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

EGFR屬于跨膜蛋白，主要參與血管上皮形成，在細(xì)胞膜信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用。EGFR在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用，在胃癌、肝癌、乳腺癌、直腸癌及宮頸浸潤(rùn)癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)。有研究顯示，EGFR在鱗癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且與浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明EGFR在宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其過(guò)表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的高增殖、易轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為宮頸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[18-19]。另有研究顯示，EGFR參與腫瘤細(xì)胞血管生成，可以直接或間接刺激腫瘤細(xì)胞，EGFR為血管發(fā)生的受體，在腫瘤細(xì)胞血管表皮中表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示，EGFR在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中均表達(dá)，轉(zhuǎn)染COX-2siRNA后，EGFR的基因與蛋白表達(dá)水平均降低，且流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后能夠明顯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，可能原因?yàn)镃OX-2基因沉默后通過(guò)下調(diào)EGFR基因表達(dá)，抑制HeLa細(xì)胞遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。

本研究采用細(xì)胞流式儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞穿透率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。以上結(jié)果間接表明，COX-2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，可能是通過(guò)調(diào)控VEGF和EGFR的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，siRNA靶向沉默HeLa細(xì)胞中的COX-2基因，能夠抑制其基因及蛋白表達(dá)水平，同時(shí)使VEGF和EGFR的基因及蛋白表達(dá)水平降低，進(jìn)一步降低HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。