張兵，董斌#，封亞萍，韓彥博，楊新華，于兵兵

1平頂山市口腔醫(yī)院綜合科，河南 平頂山467000

解放軍第一五二中心醫(yī)院2腫瘤科，3病理科，河南 平頂山4670000

口腔癌是中國(guó)目前發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，大部分屬于上皮源性鱗狀細(xì)胞癌，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，舌癌是發(fā)病率最高的口腔惡性腫瘤，與其他頭頸部的惡性腫瘤相比，舌癌的浸潤(rùn)性強(qiáng)，惡化程度高，明顯影響患者的咀嚼、吞咽、呼吸等重要功能，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。目前，臨床上主要采取以外科手術(shù)為基礎(chǔ)的綜合序列治療方案，雖然越來越多的抗癌藥物和靶向藥物應(yīng)用于舌癌治療，但是由于舌癌具有高復(fù)發(fā)率和高遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率等特點(diǎn)[2]，導(dǎo)致患者的5年生存情況并不理想，因此，尋找早期特異性腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高對(duì)舌癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估能力具有十分重要的臨床價(jià)值，是舌癌治療領(lǐng)域長(zhǎng)期研究的重點(diǎn)。舌癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移涉及諸多因素，是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過程，Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2（Srchomology phosphotyrosinephosphatase2，Shp2）是參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平的關(guān)鍵酶之一，廣泛表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中[3]。有研究顯示，Shp2與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]，已經(jīng)作為血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病及實(shí)體腫瘤如乳腺癌、肺癌等臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物[5]。但目前關(guān)于Shp2在舌癌組織中的表達(dá)及其可能的作用機(jī)制的研究尚未見明確報(bào)道。本研究通過探討Shp2在舌癌組織中的表達(dá)及其對(duì)舌癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為舌癌的臨床診斷、預(yù)后提供新的研究思路，為臨床治療提供潛在的分子靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2017年1月至2018年2月于解放軍第一五二中心醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋舌癌組織標(biāo)本45例（由病理科醫(yī)師對(duì)組織切片復(fù)檢）和癌旁正常組織標(biāo)本13例。舌癌組織標(biāo)本取自29例男性患者和16例女性患者，患者的年齡為31～79歲，平均年齡為（58.7±7.9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有舌癌組織標(biāo)本均經(jīng)鏡下病理組織檢查證實(shí)；患者均為首次診斷，術(shù)前均未接受放化療或其他相關(guān)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位的惡性腫瘤患者，合并其他嚴(yán)重干預(yù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重大疾病患者。

1.2 材料

人舌癌Cal-27細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Shp2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物和干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾靶序列均由上海生工生物工程有限公司合成并提供，免疫組織化學(xué)染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物公司，Opti-MEM、高糖DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）細(xì)胞消化液購(gòu)自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和鏈霉素-青霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生理鹽水購(gòu)自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

HERAcell150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)以及各種型號(hào)的移液器購(gòu)自德國(guó)Eppndorf公司，DI-CJ-2ND超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，實(shí)時(shí)定量PCR儀、iMake多功能酶標(biāo)儀、SDS-PAGE電泳儀和電轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，CX41倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司，電子分析天平購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，Amersham電泳儀購(gòu)自瑞典Bioscience公司，恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽均購(gòu)自北京六一儀器廠，流式細(xì)胞儀和Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司，LAS-4000 mini凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)購(gòu)自日本FujiFilm公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 按照即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）試劑盒說明書進(jìn)行操作。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察Shp2在Cal-27細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)情況。Shp2的陽(yáng)性著色表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕黃色表達(dá)。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度評(píng)分，0分為無(wú)染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強(qiáng)染色，然后計(jì)算10個(gè)視野的平均染色分值。同時(shí)根據(jù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例為0計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例﹤25%計(jì)為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例為25%～50%計(jì)為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例為51%～75%計(jì)為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例＞75%計(jì)為4分。兩項(xiàng)積分相乘總分≤1分為“—”表達(dá)，2～5分為“+”表達(dá)，6～10分為“++”表達(dá)，﹥10分為“+++”表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Cal-27細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24～48 h更換培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞狀態(tài)。每隔48 h傳代1次。

1.3.3 Shp 2慢病毒干擾載體構(gòu)建 選擇pGMLVSB1 RNAi慢病毒載體，由上海吉瑪公司構(gòu)建并提供慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)。采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，測(cè)定慢病毒滴度。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天，以5×105/孔細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組：對(duì)照組，只加入LipofectamineTM2000，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染；陰性組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC；Shp2-siRNA組：轉(zhuǎn)染Shp2-siRNA。在EP管中分別加入5 μl預(yù)先配置的Shp2 siRNA或?qū)φ誷iRNA溶液，以及250 μl的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻，室溫放置10 min；另外，在5 μl LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體溶液中加入 250 μl的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液，振蕩混勻后，室溫放置10 min；將上述兩種溶液吹打混勻，室溫放置30 min；將脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合液滴加至孔板細(xì)胞表面，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細(xì)胞RNA及蛋白，驗(yàn)證目的基因的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。

1.3.5 噻唑藍(lán)法檢測(cè) 采用噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將3組Cal-27細(xì)胞（1×104/孔）單層接種至96孔板中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置8個(gè)平行孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入20 μl的MTT，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入 200 μl的 二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育振蕩反應(yīng)5 min，置于顯微鏡下觀察無(wú)紫色結(jié)晶物。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。將3組Cal-27細(xì)胞（1×104/孔）單層接種至Transwell小室內(nèi)；從小室的側(cè)空采用移液器加入500 μl含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基；將Transwell小室置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。蘇木素染色，Transwell小室濾膜；置于倒置光學(xué)顯微鏡中計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 先用marker筆在6孔板背后，用直尺均勻地劃?rùn)M線，每隔0.5～1.0 cm劃一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線；每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞；次日，待細(xì)胞貼壁后，標(biāo)記劃痕；用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基；置入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、6、12、24 h取樣，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 收集3組的Cal-27細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后，1000 r/min離心5 min，離心半徑為19 cm。棄除上清液；加入500 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量約為1×104/ml；加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexin V-fluorescein isothiocyanat，Annexin V-FITC）5 μl，室溫下避光孵育15 min；1000 r/min（離心半徑19 cm）離心5 min，棄除上清液；加入500 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μl，室溫下避光孵育15 min；1000 r/min離心5 min，離心半徑為19 cm，棄除上清液；加入300 μl的結(jié)合緩沖液。根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒的操作說明檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞 1×107/ml，加入 100 μl的細(xì)胞裂解液，冰浴裂解30 min，3000 rpm離心15 min，取上清液；采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔道加入總蛋白50 μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）約2 h。電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后，采用5%的脫脂奶粉封閉過夜，置于水平搖床中，4℃孵育一抗過夜（1∶500稀釋），洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），置于水平搖床中，室溫下孵育1 h，洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膜上的蛋白表達(dá)條帶，采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以積分光密度（integral optical density，IOD）表示灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Shp 2的表達(dá)情況

舌癌組織中Shp2的陽(yáng)性表達(dá)率為82.22%（37/45），明顯高于癌旁正常組織的23.08%（3/13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.838，P﹤0.01）。

2.2 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞增殖的影響

3組Cal-27細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組Cal-27細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；而Shp2-siRNA組中Cal-27細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 沉默Shp 2后不同時(shí)間點(diǎn)Cal-27細(xì)胞OD值的比較（±s）

表1 沉默Shp 2后不同時(shí)間點(diǎn)Cal-27細(xì)胞OD值的比較（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別24 h 48 h 72 h 96 h

2.3 Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞體外侵襲能力的影響

空白對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（118.38±16.62）個(gè)，陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（115.63±17.54）個(gè)，Shp2-siRNA組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（57.50±16.83）個(gè)，3組Cal-27細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.721，P﹤0.01）。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組Cal-27細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；而Shp2-siRNA組中Cal-27細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。

2.4 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞體外遷移能力的影響

3組Cal-27細(xì)胞在6、12、24 h的遷移率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.75、16.62、106.72，P﹤0.01）?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組中Cal-27細(xì)胞在6、12、24 h的遷移率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；Shp2-siRNA組中Cal-27細(xì)胞在6、12、24 h的遷移率均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞遷移率的影響（%，±s）

表2 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞遷移率的影響（%，±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 24 h

2.5 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞凋亡的影響

干擾72 h后，Shp2-siRNA組Cal-27細(xì)胞的凋亡率為（16.14±3.17）%，空白對(duì)照組Cal-27細(xì)胞的凋亡率為（3.96±2.29）%，陰性對(duì)照組Cal-27細(xì)胞的凋亡率為（4.35±2.68）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.17，P﹤0.01）。與空白對(duì)照組比較，Shp2-siRNA組和陰性對(duì)照組的Cal-27細(xì)胞凋亡率均有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。

2.6 沉默Shp 2對(duì)Cal-27細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和Bcl- 2表達(dá)的影響

3組Cal-27細(xì)胞中的p53、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.59、21.56、18.22，P﹤0.01）。Shp2-siRNA 組中的 p53、Bax蛋白表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組Cal-27細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表 3）

表3 不同組別Cal-27細(xì)胞中 p53、Bax和Bcl- 2蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表3 不同組別Cal-27細(xì)胞中 p53、Bax和Bcl- 2蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與空白對(duì)照組比較，P＜05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組Shp2-siRNA組p53 0.414±0.100 0.427±0.131 0.782±0.146a b Bax 0.495±0.131 0.517±0.156 0.892±0.118a b Bcl-2 0.404±0.093 0.385±0.102 0.158±0.075a b

3 討論

目前，臨床上關(guān)于頭頸部惡性腫瘤仍以外科手術(shù)切除為主，配合化療和放療輔助治療，尋找能夠反映患者生理狀況和細(xì)胞變化的生物標(biāo)志物對(duì)于準(zhǔn)確診斷疾病和評(píng)估預(yù)后具有十分重要的臨床價(jià)值[6]。舌癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，惡化程度較高，預(yù)后差，尤其是晚期舌癌患者，易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是治療失敗的主要原因[7]，因此，早診斷、早治療是改善患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者生存期的主要手段[8]。Shp2是由PTPN11基因編碼的、廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的非受體型酪氨酸磷酸酶，在多種腫瘤組織中呈過度活化狀態(tài)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，舌癌組織中Shp2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（P﹤0.01），表明Shp2可能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，Shp2在肝癌組織中呈低表達(dá)，發(fā)揮類似抑癌基因的作用[11]。因此，在不同的腫瘤細(xì)胞中，Shp2可能表現(xiàn)不同的生理活性。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于探討Shp2在舌癌組織中的表達(dá)水平及其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用的研究尚少，因此，本研究著重探討了Shp2在舌癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)及其對(duì)舌癌Cal-27細(xì)胞體外增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響，探討Shp2在舌癌中表達(dá)的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，Shp2在癌旁正常組織中呈低表達(dá)。另外，本研究結(jié)果顯示，Shp2表達(dá)于細(xì)胞漿中，與有關(guān)研究結(jié)果類似[12]，提示Shp2可作為舌癌診斷和治療的潛在分子靶點(diǎn)。但是Tassidis等[13]通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)Shp2在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Shp2不僅在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)上調(diào)，而且在細(xì)胞核中也呈高表達(dá)，據(jù)推測(cè)，不同腫瘤組織中Shp2的表達(dá)部位有可能存在差異，因此，Shp2發(fā)揮的病理生理作用也可能不同。

RNA干擾技術(shù)是目前較為成熟的研究靶基因功能的實(shí)驗(yàn)室手段，可特異性剔除或關(guān)閉某種靶基因的表達(dá)；慢病毒載體是一類轉(zhuǎn)染率較高的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，本研究通過采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，構(gòu)建Shp2慢病毒干擾載體，探討Shp2在Cal-27細(xì)胞中增殖、遷移、凋亡等體外生物學(xué)過程中的作用。細(xì)胞具有增殖、分化、衰老、凋亡等方面的特性，通過相互協(xié)調(diào)，共同維持正常的生理活動(dòng)[14]。增殖失控和凋亡受到抑制是腫瘤細(xì)胞不同于正常細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，即細(xì)胞增殖和凋亡失衡導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量異常增加，從而為腫瘤的形成提供關(guān)鍵的病理基礎(chǔ)[15]。因此，腫瘤既是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，也是凋亡性疾病。本研究結(jié)果顯示，Shp2基因沉默后，Cal-27細(xì)胞的增殖活性受到抑制，凋亡率增加，提示Shp2在促進(jìn)舌癌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的類似癌基因的作用。另外，Bax/Bcl-2、p53蛋白等是參與細(xì)胞凋亡的主要蛋白分子，其中，Bcl-2位于細(xì)胞凋亡調(diào)控通路的終末端，是最重要的促癌基因，具有抗凋亡作用。Bax是p53蛋白轉(zhuǎn)錄的靶基因，可作用于線粒體膜上的電壓依賴性離子通道，具有促凋亡作用。p53通過上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究為了證實(shí)Shp2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，通過Western blot法檢測(cè)了沉默Shp2基因后對(duì)Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Shp2siRNA干擾載體后，Cal-27細(xì)胞中p53和Bax的表達(dá)水平升高，而Bcl-2表達(dá)水平下降，提示Shp2抑制腫瘤凋亡的作用機(jī)制可能與p53調(diào)控的Bax/Bcl-2比例變化有關(guān)。另外，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是舌癌患者預(yù)后不良的主要因素。有研究顯示，Shp2在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有正向調(diào)控作用，并通過調(diào)控細(xì)胞的黏附能力為乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供有利的條件[16]。本研究通過Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Shp2基因沉默后，Cal-27細(xì)胞遷移能力降低，推測(cè)Shp2促進(jìn)舌癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖及增加細(xì)胞黏附能力有關(guān)。

綜上所述，Shp2在舌癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，采用慢病毒介導(dǎo)Shp2基因沉默后，Cal-27細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力受到抑制，同時(shí)，凋亡能力增強(qiáng)，凋亡相關(guān)蛋白Bax、p53的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，提示Shp2在舌癌組織中具有促癌基因的活性，可作為舌癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物以及潛在的基因治療靶點(diǎn)。