鄭鴻，祝子華

1復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院化療科，上海200240

2復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院消化科，上海2011990

大多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入量明顯高于正常細(xì)胞，即使在不缺氧的情況下也是優(yōu)先發(fā)生糖酵解，從而產(chǎn)生乳酸，這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)[1]。乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase-A，LDH-A）是糖酵解的重要代謝酶，有研究表明，和正常組織相比，LDH-A在很多腫瘤組織中呈高表達(dá)，例如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等，提示LDH-A與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關(guān)系[2-4]。既往對(duì)于LDH-A的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平方面，隨著蛋白質(zhì)修飾的研究成為熱點(diǎn)，LDH-A的乙?；芯咳諠u深入，根據(jù)已有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，LDH-A存在8個(gè)潛在的乙?；稽c(diǎn)[5]。Zhao等[10]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LDH-A的乙?；饕l(fā)生于LDH-A第5位點(diǎn)賴氨酸殘基上，LDH-A乙酰化能夠影響LDH-A酶的活性和蛋白穩(wěn)定性，還能夠促進(jìn)LDH-A通過分子伴侶介導(dǎo)的溶酶體途徑降解，在胰腺癌中LDH-A的乙?；浇档?，由此使得LDH-A酶活力增加和LDH-A積累，從而促進(jìn)了腫瘤的能量代謝，加速了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有關(guān)LDH-A乙酰化與結(jié)直腸腺癌關(guān)系的報(bào)道較為少見。本研究探討了LDH-A乙?；诮Y(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析了LDH-A乙酰化與結(jié)直腸腺發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年5月由復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院提供的結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)手術(shù)切除和病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸腺癌；患者的臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：原位癌患者；具有第二原發(fā)腫瘤病史的患者；混合性腺磷癌患者。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入結(jié)直腸腺癌患者40例。40例結(jié)直腸腺癌患者中，男26例，女14例；年齡為42～91歲，中位年齡為68歲；分化程度：中高分化24例，低分化16例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期12例；Ⅲ～Ⅳ期28例。另選取相應(yīng)的40例癌旁正常組織（距癌組織﹥5 mm）標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)檢測方法 乙?；疞DH-A抗體由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)研究院提供。檢測方法：免疫組織化學(xué)檢測。具體操作：①脫蠟水化，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次2 min。②抗原修復(fù)，用PBS沖洗3次，每次2 min。③滴加100 μl的過氧化物酶封閉劑，室溫下孵育10 min，用PBS沖洗3次，每次2 min。④滴加100 μl的一抗，室溫下孵育30～60 min，PBS沖洗3 min，每次2 min。⑤滴加100 μl的二抗（乙?；疞DH-A抗體按1∶10 000稀釋），室溫下孵育1～2 h。PBS沖洗3 min，每次2 min。⑥配制二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）工作液，取DAB色原和DAB緩沖液各50 μl，加入 1 ml蒸餾水，混勻備用。⑦取 100 μl的DAB工作液滴加在組織膠片上顯色2～10 min。⑧自來水沖洗，終止顯色。⑨用蘇木紫染色液復(fù)染，分化，返藍(lán)。⑩顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并對(duì)陽性染色面積進(jìn)行分析并拍照。

1.2.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在顯微鏡下觀察結(jié)直腸腺癌組織中乙?；疞DH-A蛋白的陽性表達(dá)情況，比較不同臨床特征結(jié)直腸腺癌患者乙?；疞DH-A蛋白的陽性表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果判定：乙?；疞DH-A蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿，部分表達(dá)于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)。在200倍顯微鏡下，每張組織切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，由兩名病理科醫(yī)師在未知任何病理資料和臨床資料的情況下對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0分，染色強(qiáng)度弱為1分，染色強(qiáng)度中等為2分，染色強(qiáng)為3分；陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：﹤5%為0分，5～25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，﹥75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終得分，0～7分則為陰性表達(dá)，8～12分則為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙?；疞DH-A蛋白表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸癌組織中的乙?；疞DH-A蛋白陽性表達(dá)率為22.5%（9/40），低于癌旁正常組織的47.5%（19/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.50，P﹤0.05）。

2.2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者乙?；疞DH-A蛋白表達(dá)情況的比較

Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本中乙?；疞DHA蛋白的陽性表達(dá)率高于Ⅲ～Ⅳ期的結(jié)直腸腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.97，P﹤0.05）。不同年齡、性別、分化程度結(jié)直腸腺癌患者中乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者乙?；疞DH-A蛋白表達(dá)情況的比較

3 討論

近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，但其發(fā)病的確切機(jī)制尚不明確。腫瘤能量代謝的改變是惡性腫瘤細(xì)胞重要的代謝特征[6]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞顯著的代謝特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞能夠通過葡萄糖酵解大量攝取葡萄糖，從而產(chǎn)生能量以滿足其增殖的能量需求，并產(chǎn)生較多的乳酸。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一種糖酵解酶，在腫瘤細(xì)胞糖酵解過程中具有重要的作用。在腫瘤細(xì)胞中，大部分的丙酮酸不是作為能量原料進(jìn)入線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化來產(chǎn)能的，而是經(jīng)LDH轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，通過糖酵解滿足腫瘤的快速生長的；過量的乳酸對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有分解破壞的作用，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤血管的形成[7-8]。因此，腫瘤的生長與LDH密切相關(guān)。LDH是一個(gè)多基因位點(diǎn)的同工酶，其中，LDH-A是其中的一種亞基類型。LDH-A的表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。Le等[8]報(bào)道了在腫瘤患者體內(nèi)通過RNA干擾LDH-A或藥物抑制LDH-A能夠阻止腫瘤的進(jìn)展。Fantin等[9]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的LDH-A水平下降，腫瘤的生長受到抑制，荷瘤小鼠的存活期延長。LDH-A抑制劑則能夠減少腫瘤細(xì)胞中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，從而抑制腫瘤的生長[10]。這些研究均說明了LDH-A在腫瘤的代謝和腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用，并可能成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。

然而，以往的研究主要集中于LDH-A轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。但近年來，細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物代謝和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)雀鞣N途徑都離不開蛋白質(zhì)翻譯后修飾的調(diào)控。其中，蛋白質(zhì)的乙?；鳛橐环N重要的翻譯后修飾受到越來越多的關(guān)注，如非組蛋白的乙?；?，尤其是代謝酶的乙酰化研究成為熱點(diǎn)。這些代謝酶參與細(xì)胞中的各種代謝途徑，如糖代謝、脂類代謝、氨基酸代謝等，從而影響細(xì)胞代謝和疾病的發(fā)生。乙?；{(diào)控代謝酶的方式多種多樣，例如調(diào)節(jié)代謝酶的催化活性，影響代謝酶的蛋白穩(wěn)定性，控制代謝酶的亞細(xì)胞定位等，從而影響細(xì)胞的代謝和疾病的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中的乙?；疞DH-A蛋白陽性表達(dá)率為22.5%（9/40），低于癌旁正常組織的47.5%（19/40）（P﹤0.05）。這表明乙?；疞DH-A可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮了負(fù)性調(diào)控作用，提示采用乙?；愃莆锾娲鷥?nèi)生性的LDH-A可能降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。這與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中，乙?；疞DH-A不僅能夠減少LDH-A的催化活性[10-11]，還能夠降低LDH-A蛋白的表達(dá)水平的結(jié)論相一致。這一現(xiàn)象可能為今后臨床靶點(diǎn)治療提供新思路。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中乙?；疞DH-A蛋白的陽性表達(dá)率高于Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌患者（P﹤0.05）。不同年齡、性別、分化程度結(jié)直腸腺癌患者的結(jié)直腸腺癌組織中乙?；疞DH-A蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。表明在結(jié)直腸腺癌早期，其LDH-A乙?；谋磉_(dá)水平高于結(jié)直腸腺癌晚期，提示LDH-A乙?；赡茉诮Y(jié)直腸癌的發(fā)展中存在一定的下調(diào)。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌乙?；皆诮Y(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，提示其與結(jié)直腸癌的發(fā)生可能存在一定的關(guān)系，LDH-A乙?；赡茉诮Y(jié)直腸癌的發(fā)展中起到負(fù)性調(diào)節(jié)的重要作用，即LDH-A乙?；赡芤种平Y(jié)直腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展。