何寶明 柏瑩 李艷琴

[摘要] 目的 探討microRNA-221（miR-221）對結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞后炎癥因子水平的影響。 方法 用qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細胞中miR-221的表達；用miR-221模擬物和miR-221抑制物轉(zhuǎn)染結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法和Griess法分別檢測炎癥因子表達和NO分泌；雙熒光素酶報告基因、qRT-PCR和Western blot法檢測miR-221和Rho相關蛋白激酶1（ROCK1）的靶向關系。 結(jié)果 miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中低表達；miR-221模擬物上調(diào)巨噬細胞miR-221的表達水平，抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6和NO的分泌；miR-221抑制物下調(diào)巨噬細胞miR-221的表達水平，促進巨噬細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌；miR-221可作用于ROCK1的3′UTR，并抑制其表達（P < 0.05）。 結(jié)論 miR-221通過靶向抑制ROCK1的表達抑制結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞后的炎癥因子的表達。

[關鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；單核巨噬細胞；MicroRNA-221；Rho相關蛋白激酶1；炎癥因子

[中圖分類號] R521 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（c）-0014-05

[Abstract] Objective To explore the effects of miR-221 on the inflammatory factor secretion from macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection. Methods The expression of miR-221 in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection was detected by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. Macrophages were transiently transfected with miR-221 mimic or miR-221 inhibitor. The expression of macrophage inflammatory factor and secretion of NO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and Griess method， respectively. The relationship of miR-221 and Rho-associated， coiled-coil containing protein kinase 1 （ROCK1） was analyzed by dual-luciferase reporter gene assay， qRT-PCR and Western blot. Results Down-regulated miR-221 was observed in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. The expression of miR-221 in macrophages was up-regulated by miR-221 mimics， but down-regulated by miR-221 inhibitors. The secretions of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO were significantly accelerated in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis， and increased in miR-221 up-regulated macrophages， but suppressed in miR-221 down-regulated macrophages. miR-221 directly binds to the 3′UTR of ROCK1， and negatively regulated its expression. Conclusion miR-221 can regulate the ROCK1 expression and inhibit the secration of inflammatory factors expression in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Monocyte-derived macrophages； MicroRNA-221； Rho-associated， coiled-coil containing protein kinase 1； Inflammatory factors

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的一種慢性傳染性疾病[1]。巨噬細胞在肺結(jié)核的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[2]。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，主要被巨噬細胞吞噬，隨后巨噬細胞產(chǎn)生和分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IL-6等多種細胞因子介導機體的殺菌過程[3]。同時，感染細菌的巨噬細胞內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）的活性隨時間的延長升高，導致NOS的催化底物NO的的含量增加，此NO會作為強抗炎氧化劑促進殺滅結(jié)核分枝桿菌[3]。因此，炎癥因子和NO在肺結(jié)核的疾病進程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-221能夠通過調(diào)節(jié)各類炎癥因子的表達，在免疫反應過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。據(jù)報道，microRNA-221（miR-221）在結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核患者中表達降低[6-7]。本研究探討miR-221在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

結(jié)核分枝桿菌強毒株H37Rv（美國ATCC公司）；HEK293細胞（中國科學院上海細胞庫）；miR-221模擬物、抑制物（上海吉瑪生物制藥技術有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海BlueGene公司）。

1.2 細菌制備

細菌初次傳代后培養(yǎng)6～7 d[8]，收集菌液，制成單細菌懸液，再調(diào)整濃度至4×107個/mL。

1.3 細胞分離和培養(yǎng)

巨噬細胞分離自健康人的外周血（陜西省漢中市中心醫(yī)院檢驗科采集），方法如文獻[9]所述。取健康人的靜脈血，將血液離心得到單核細胞。洗滌去除血小板后，用含20%人血清白蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換1次液，7～10 d后即可自然分化成巨噬細胞。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的巨噬細胞，用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染miR-221模擬物、miR-221抑制物以及相應的陰性對照，培養(yǎng)48 h。

1.5 細菌感染巨噬細胞

巨噬細胞與結(jié)核分枝桿菌的比例為1∶5，在含0.4%人血清白蛋白RPMI 1640培養(yǎng)基中混合[6]，37℃孵育24、48、72 h后收集細胞。

1.6 ELISA檢測

收集細胞培養(yǎng)上清，用ELISA法分別檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。實驗重復3次。

1.7 Griess法

收集培養(yǎng)上清液，加Griess試劑反應10 min，檢測吸光度（OD550 nm）值，計算NO濃度，實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因

雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建：對ROCK1的3′UTR序列與miR-221相互作用進行預測，且對相互作用的靶點進行序列突變（Mut ROCK1），并將突變序列插入到pGL3熒光素酶報告載體的XbaI/FseI位點。PCR擴增ROCK1包含miR-221假定結(jié)合位點的3'UTR cDNA，并將擴增出的序列連接于pGL3雙熒光素酶報告基因載體上。將HEK293細胞種于24孔板中，將pGL3-ROCK1 3′-UTR與miR-221模擬物共轉(zhuǎn)染于細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，在酶標儀上檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.9 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用TRIzol提取細胞總RNA。miR-221的檢測：100 ng總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以U6為內(nèi)參基因，用qRT-PCR試劑盒檢測miR-221表達水平。ROCK1的檢測：2 μg RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，qRT-PCR試劑盒檢測ROCK1表達水平。用2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

1.10 Western blot

細胞經(jīng)RIPA裂解后，用BCA法測蛋白濃度，等量蛋白樣本上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，加兔抗人ROCK1抗體，4℃孵育過夜；用TBST洗膜后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，洗膜后，ECL化學發(fā)光顯色，實驗重復3次。

1.11 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌感染降低巨噬細胞miR-221的表達

在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞不同時間后，miR-221的表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 miR-221模擬物和miR-221抑制物改變巨噬細胞miR-221的表達水平

將miR-221模擬物或miR-221抑制物轉(zhuǎn)染入巨噬細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-221模擬物組的miR-211表達高于模擬物對照組，同時miR-221抑制物組的miR-211表達低于抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 miR-221抑制結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細胞炎癥因子的分泌

感染組、模擬物對照組、抑制物對照組巨噬細胞TNF-α、IL-1、IL-6的表達高于對照組，miR-221模擬物組的TNF-α、IL-1、IL-6表達低于模擬物對照組，miR-221抑制物組的TNF-α、IL-1、IL-6表達高于抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 miR-221抑制結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細胞NO的釋放

感染組、模擬物對照組、抑制物對照組的NO釋放量高于對照組，miR-221模擬物組的NO量高于模擬物對照組，miR-221抑制物組的NO量低于抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4。

2.5 miR-221對ROCK1的調(diào)控作用

用靶基因預測軟件（TargetScan）發(fā)現(xiàn)，在多種炎癥疾病中起重要作用的分子ROCK1是miR-221的一個靶基因（圖5A）。雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，過表達miR-221，靶基因ROCK1 3′UTR區(qū)活性明顯受到抑制（P < 0.05，圖5B）。檢測miR-221對結(jié)核分枝桿菌感染細胞中ROCK1表達的影響，感染組、模擬物對照組、抑制物對照組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達高于對照組，miR-221模擬物組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達低于模擬物對照組，miR-221抑制物組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達高于抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05，圖5C～D）。

3 討論

巨噬細胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細胞和宿主細胞，該細胞在結(jié)核分枝桿菌引起的免疫反應中起重要作用[10]。機體感染結(jié)核桿菌后，巨噬細胞被激活，高表達NOS和L-精氨酸，并在四氫生物碟呤的存在下，催化產(chǎn)生非特異性的殺菌物質(zhì)NO，參與抗感染早期過程[11]。同時活化的巨噬細胞促進TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子大量釋放，活化炎癥細胞，增強機體對結(jié)核分枝桿菌的殺傷功能。本實驗中巨噬細胞用結(jié)核分枝桿菌感染后TNF-α、IL-1、IL-6釋放顯著增加。

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在肺結(jié)核患者血液中異常表達[12]。如miR-21[13]、miR-146a[14]和miR-144[2]等。據(jù)報道m(xù)iR-221可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)炎癥相關因子的表達[4]，可通過靶向調(diào)節(jié)脂聯(lián)素受體1調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的炎性反應[5]。Ni等[6]發(fā)現(xiàn)miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中表達降低。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞后，miR-221表達顯著降低，與現(xiàn)有文獻報道[6]一致。此外，通過在巨噬細胞中轉(zhuǎn)染miR-221模擬物及抑制物，提示miR-221模擬物降低炎性因子和NO分泌，miR-221抑制物促進炎性因子和NO分泌，提示巨噬細胞可能通過調(diào)節(jié)miR-221的表達，抑制結(jié)核分枝桿菌的免疫清除。

ROCK是炎癥疾病中的關鍵調(diào)節(jié)分子，在脊髓損傷[15]、急性肺損傷[16]和心血管疾病[17-18]等多種炎癥疾病中起重要作用。ROCK以ROCK1和ROCK2兩種異構(gòu)體形式存在。ROCK1對炎癥細胞的黏附起重要的調(diào)節(jié)作用[19]，且有實驗證明ROCK1可激活巨噬細胞介導的炎性反應[20]。本研究用生物信息學的方法預測出miR-221與ROCK1存在良好的堿基互補關系，并通過雙熒光素酶報告基因、qRT-PCR和Western blot提示miR-221可靶向調(diào)控ROCK1的表達。

綜上所述，miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中表達降低，miR-221負性調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘發(fā)的巨噬細胞免疫應答，并可靶向抑制ROCK1 mRNA和蛋白的表達，為研究巨噬細胞在機體內(nèi)的免疫機制提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Mjid M，Cherif J，Ben Salah N，et al. Epidemiology of tuberculosis [J]. Rev Pneumol Clin，2015，71（2/3）：67-72.

[2] Liu HY. Down-regulation of miR-144 after Mycobacterium tuberculosis infection promotes inflammatory factor secretion from macrophages through the Tpl2/ERK pathway [J]. Cell Mol Biol（Noisy-le-grand），2016，62（2）：87-93.

[3] 程濤，伍偉玲，黃河.肺結(jié)核患者Th1/Th2/Treg/Th17免疫應答的臨床研究[J].中國醫(yī)藥導報，2017，14（26）：109-112.

[4] Marques-Rocha JL，Samblas M，Milagro FI，et al. Noncoding RNAs，cytokines，and inflammation-related diseases [J]. FASEB J，2015，29（9）：3595-3611.

[5] Chen CF，Huang J，Li H，et al. MicroRNA-221 regulates endothelial nitric oxide production and inflammatory response by targeting adiponectin receptor 1 [J]. Gene，2015， 565（2）：246-251.

[6] Ni B，Rajaram MV，Lafuse WP，et al. Mycobacterium tuberculosis decreases human macrophage IFN-gamma responsiveness through miR-132 and miR-26a [J]. J Immunol，2014，193（9）：4537-4547.

[7] Barry SE，Chan B，Ellis M，et al. Identification of miR-93 as a suitable miR for normalizing miRNA in plasma of tuberculosis patients [J]. J Cell Mol Med，2015，19（7）：1606-1613.

[8] Lundqvist-Gustafsson H，Norrman S，Nilsson J，et al. Involvement of p38-mitogen-activated protein kinase in Staphylococcus aureus-induced neutrophil apoptosis [J]. J Leukoc Biol，2001，70（4）：642-648.

[9] Schlesinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors [J]. J Immunol，1993，150（7）：2920-2930.

[10] Torres-Juarez F，Cardenas-Vargas A，Montoya-Rosales A，et al. LL-37 immunomodulatory activity during Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages [J]. Infect Immun，2015，83（12）：4495-4503.

[11] Huang S，Robinson JB，Deguzman A，et al. Blockade of nuclear factor-kappaB signaling inhibits angiogenesis and tumorigenicity of human ovarian cancer cells by suppressing expression of vascular endothelial growth factor and interleukin 8 [J]. Cancer Res，2000，60（19）：5334-5339.

[12] Xu Z，Zhou A，Ni J，et al. Differential expression of miRNAs and their relation to active tuberculosis [J]. Tuberculosis，2015，95（4）：395-403.