任明偉

摘 要 本文從生物納米孔的%Z-HL納米孔、Aerolysin納米孔、MspA納米孔、噬菌體phi29連接器的四種分類出發(fā)，對生物納米孔分析技術的應用與發(fā)展進行了分析，納米孔分析技術的發(fā)展，特別是近年來在DNA測序得到了廣泛應用。

關鍵詞 生物納米孔 DNA測序

中圖分類號：Q819 文獻標識碼：A

0前言

納米孔技術作為低成本、高效率的DNA檢測技術，研究已經(jīng)取得了巨大進步。本文著重介紹分子生物學技術的組合，以及納米孔技術的新進展。

1生物納米孔的種類

1.1 %Z-HL納米孔

%Z-HL生物通道蛋白被用于構建了第一個納米孔，也是目前應用最為廣泛的生物納米孔。%Z-HL是金黃色葡萄球菌分泌的一種多肽毒素，含有293個氨基酸，相對分子質量為3.32？04，可通過自組裝形成七聚體的跨膜通道，這一蘑菇狀的納米通道由一個較大的膜外前庭和一個%[-桶狀結構的跨膜莖部組成。%Z-HL優(yōu)異的性質使其成為目前應用最為廣泛的生物納米通道：首先，%Z-HL易于自組裝和結構穩(wěn)定，電導均勻，使得分析物產(chǎn)生的阻斷事件可重復；第二，%Z-HL對分析物本質上是非選擇性的，確保電流阻斷事件是由要測量的各個分子的體積效應引起的。第三，%Z-HL腔對基因突變或化學修飾敏感，以實現(xiàn)特異性檢測。

1.2 Aerolysin納米孔

Aerolysin是一種從嗜水氣單胞菌中提取的%[-致孔菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，與人體腹瀉和深部傷口有關。成熟的Aerolysin可以與真核細胞膜表面的糖蛋白受體相互作用。合并并插入細胞膜形成孔，改變膜通透性并最終導致細胞死亡。Aerolysin單體在水溶液中自發(fā)形成具有蘑菇形狀的七聚體結構，寬約15nm，高約7.0nm，孔徑為1.0至1.7nm。其形狀和存在廣泛用于納米孔技術的%Z-HL類似，但在順式末端沒有前庭結構。

1.3 MspA納米孔

MspA是恥垢分枝桿菌恥垢分枝桿菌外膜的主要組分。MspA納米孔是由相對分子質量為2.0？04的MspA單體蛋白構成的同型八聚體，類似于在最窄點處直徑約1.2nm且長度約0.5nm的煙囪。這是一個很好的納米孔檢測傳感器。

1.4噬菌體phi29連接器

噬菌體phi29連接器主要由12個gp10亞基組成，形成～7.0nm通道，直徑3.6nm，開放端寬6.0nm。在高鹽強酸堿環(huán)境（pH=2.0-12）下，噬菌體phi29連接器通道仍能保持穩(wěn)定的通道特性。目前，關于噬菌體phi29連接器研究最多的是一種6-packRNA（pRNA）和ATPase蛋白gp16，它們組裝成噬菌體phi29包裝馬達，作為復雜的納米孔研究。由于通道的直徑較大，可以實現(xiàn)較大的生物分子如dsDNA和高分子量聚合物的檢測。

2生物納米孔分析技術的應用與發(fā)展

迄今為止，DNA是納米孔研究中最常見的聚合物，脂質嵌入的離子通道檢測DNA是該研究的突破性實例。最近，固態(tài)納米孔已被用于檢測核小體結構和RNA聚合酶的差異，催化DNA轉錄的關鍵部分，為理解染色體結構和轉錄研究創(chuàng)造了新的機會。一些蛋白質在運輸過程中“減壓”，運輸過程可用于測量減壓動力學。已經(jīng)研究了許多這些蛋白質的減壓行為，并且納米孔可以被動態(tài)地用作不需要標記的高效力光譜儀。為了研究大腦對藥物的化學反應，重要的神經(jīng)遞質也被動態(tài)地實時區(qū)分開來。與其檢測技術相比，納米孔更有前途，效率高，速度快，價格低廉，且具有良好的準確性和檢測性能。

2.1大型固態(tài)納米孔可以用來動態(tài)地捕獲釋放的細菌

為動態(tài)捕獲單個單元提供更快，更便宜的方法。使用脂肽涂覆的固態(tài)納米孔，可以檢測到DNA與相鄰孔隙膜的相互作用。熱反應性聚合物的發(fā)展促進了智能納米孔的發(fā)展。智能納米孔可以用作動態(tài)響應溫度的裝置，由電解質刷組成的生物納米孔可以控制孔附近的鹽電導。

納米孔的DNA測序也已取得進展。最近的分子動力學研究表明，使用DNA聚合酶作為棘輪，通過控制DNA單鏈在石墨烯納米孔上的轉運可以獲得核苷酸序列的高精度讀數(shù)。在溶血素中使用鏈霉抗生物素蛋白可以選擇性地固定DNA鏈，這可以高分辨率地區(qū)分孔上不同幾何位置的核酸。P-n半導體結降低了DNA易位速率，可以在位移過程中動態(tài)控制電壓。采用新型基于CMSO的放大器，可以實現(xiàn)亞微秒級的電流檢測。關于DNA測序的理論研究，已經(jīng)提出了可行的建議和方法來解決上述對離子電流測量速度的限制。模擬顯示石墨烯碳納米帶上的納米孔可以使用孔邊緣處的電流密度，導致更高的分辨率。也已經(jīng)提出了垂直于納米通道放置的石墨烯碳納米帶的電導變化作為DNA堿基易位測序裝置。

2.2有機小分子檢測

生物納米孔在直接檢測小有機分子方面有一些困難。如果分子適配器可以引入到納米孔中，則適配器和分析物之間的特定相互作用可以用于檢測小的有機分子。適配器通常是一個圓形分子，它在納米孔內以非共價方式連接到孔壁，并充當納米孔和小分子之間相互作用的介質。

3結束語

生物納米孔分析技術已廣泛應用于DNA測序、蛋白質結構研究及單分子檢測等領域，且應用領域正在不斷拓寬。然而，作為一種新穎的單分子分析手段，納米孔技術在實際樣品檢測、數(shù)據(jù)處理和檢測裝置等方面也存在著諸多挑戰(zhàn)。

參考文獻

[1] Kasianowicz，J.J.&E.Brandin;&D.Branton;，etal.CharacterizationofIndividualPolynucleotideMoleculesUsingaChannel[J].ProcNatlAcadSciUSA，2016，93（24）：13770-13773.