顧磊，肖婕，文斐

[鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)病理科，黃石 435000]

胃癌是臨床上比較常見的一種惡性腫瘤，患者的死亡率以及發(fā)病率都位居消化系統(tǒng)腫瘤的首位。當(dāng)前情況下，胃癌患者的具體作用機(jī)制仍然不夠明確。不過胃癌轉(zhuǎn)移侵襲是患者預(yù)后較差的風(fēng)險因素[1]。腫瘤標(biāo)志物作為腫瘤細(xì)胞惡化過程當(dāng)中表達(dá)癌基因生成的活性物質(zhì)，在患者血液、體液以及腫瘤組織當(dāng)中都可以檢出，良性組織或者是正常組織當(dāng)中不表達(dá)或者是低表達(dá)，所以醫(yī)務(wù)人員可以通過檢測腫瘤標(biāo)志物表達(dá)來判斷患者病情[2]。本研究通過檢驗(yàn)骨橋蛋白(OPN)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(sLAG-3)、Dickkopf相關(guān)蛋白1(DKK-1)在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)，分析其同患者病理特征之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月至2017年2月我院收治的胃癌患者160例，其中男101例，女59例；年齡范圍22～69歲，年齡(35.4±2.6)歲；病程范圍2～13年，病程(8.1±0.4)年。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)過病理學(xué)檢查確診屬于胃癌；年齡超過18歲；經(jīng)過CT或者超聲胃鏡檢查進(jìn)行TNM分期；均進(jìn)行切除手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在惡性腫瘤病史；合并其他腫瘤；曾進(jìn)行免疫治療或者放化療；合并嚴(yán)重肝腎功能障礙；合并凝血功能障礙；妊娠哺乳期女性?；颊呔橥獗狙芯浚⑶冶狙芯客ㄟ^醫(yī)院倫理委員會審核。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本來源 患者手術(shù)過程當(dāng)中切取胃癌組織以及正常胃黏膜組織(距離患者的腫瘤邊緣要超過5cm)。切取之后放入液氮并且使用冰箱進(jìn)行冷凍保存。

1.3.2 OPN檢測 主要試劑為鼠抗人OPN抗體以及SP免疫試劑盒(北京金橋生物公司生產(chǎn))。具體檢測步驟方面，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行，標(biāo)本使用10%的甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋固定之后，3 μm切片。染色步驟根據(jù)免疫試劑盒的說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作，應(yīng)用PBS替代一抗進(jìn)行陰性對照，用已經(jīng)證實(shí)的OPN染色陽性切片當(dāng)作陽性對照[3]。

1.3.3 sLAG-3檢測 sLAG-3表達(dá)的檢測方面應(yīng)用固相夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA法)進(jìn)行，具體操作步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行倍比稀釋，相應(yīng)的試劑根據(jù)說明依次進(jìn)行稀釋。加樣過程當(dāng)中分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待檢測的樣品孔，其中樣品孔設(shè)置為復(fù)孔。確定之后依次添加不同濃度50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋之后的樣品，在常溫條件下持續(xù)孵育60 min。之后棄去液體并且依次添加50 μL的檢測溶液A，在常溫條件下持續(xù)孵育60 min之后洗板。甩盡板內(nèi)液體的液體之后使用洗滌液反復(fù)沖洗反應(yīng)板，在厚吸水紙上面反復(fù)拍干，之后，洗滌2次并且添加50 μL檢測溶液B，持續(xù)孵育60 min。反復(fù)洗板3次之后每孔添加30 μL的底物溶液，在室溫條件下避光顯色20 min。之后每孔添加30 μL的終止液，震蕩混勻確保顏色從藍(lán)色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀在350 nm的波長檢測各孔吸光度(OD值)。將標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)中的OD值當(dāng)作橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度當(dāng)作縱坐標(biāo)，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來判斷樣品濃度[4]。

1.3.4 DKK-1檢測 檢測使用的試劑為兔抗人GSK-3β抗體(上海斯信科技公司生產(chǎn))，兔抗人DKK-1抗體為(上海由誼忠聯(lián)公司生產(chǎn))，兔抗人β-catenin抗體、SP免疫試劑盒及DAB顯色劑(北京金橋生物公司生產(chǎn))，光學(xué)顯微鏡以及DP70圖像采集系統(tǒng)為日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。具體檢測步驟方面，取患者的石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)制成3 μm的切片，常規(guī)脫蠟之后使用微波進(jìn)行抗原的修復(fù)，使用3%的過氧化氫溶液從而阻斷標(biāo)本當(dāng)中存在的過氧化物酶活性。應(yīng)用正常山羊血清進(jìn)行封閉，為各個標(biāo)本分別滴加一抗兔抗人兔抗人GSK-3β抗體、兔抗人DKK-1抗體以及兔抗人β-catenin抗體，常溫條件下持續(xù)孵育62 min之后依次添加山羊抗兔二抗，并且應(yīng)用辣根酶來標(biāo)記蛋白素。DAB進(jìn)行顯色之后應(yīng)用蘇木精完成復(fù)染，之后分別進(jìn)行脫水、透明以及封固處理。上述實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)中，PBS替代一抗當(dāng)作陰性對照，使用陽性切片當(dāng)作陽性對照。

1.4 觀察指標(biāo) 染色程度評分方面：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。細(xì)胞比例評分方面，0分為陽性細(xì)胞的占比低于10%，1分是陽性細(xì)胞的占比在10%～25%之間，2分是陽性細(xì)胞的占比在25%～50%之間，3分是陽性細(xì)胞的占比超過50%。將染色評分以及比例評分相加得到綜合評分，其中<2分為陰性(-)，2～3分為疑似陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6分為強(qiáng)陽性(+++)，后兩者判斷屬于陽性表達(dá)[5]。

對比患者胃癌組織、癌旁組織以及正常胃黏膜組織當(dāng)中OPN、sLAG-3、DKK-1表達(dá)情況，同時分析三者同患者年齡、性別、分化程度、浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等病理特征的關(guān)系[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0分析數(shù)據(jù)，觀測數(shù)據(jù)均為計數(shù)資料。常規(guī)計數(shù)資料比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，等級計數(shù)資料比較應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織當(dāng)中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達(dá)陽性對比 胃癌組織當(dāng)中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織以及正常胃黏膜組織(P<0.05),見表1。

表1 不同組織當(dāng)中OPN、sLAG-3以及DKK-1表達(dá)陽性對比(例)

注：OPN為骨橋蛋白，sLAG-3為淋巴細(xì)胞活化基因-3，DKK-1為Dickkopf相關(guān)蛋白1，下表同；兩兩比較為分割卡方檢驗(yàn)，與癌旁組織比較，aP<0.05;與正常胃黏膜組織比較，bP<0.05

2.2 OPN蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá) OPN蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及胃癌分期等有顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系(P<0.05)，見表2。

表2 OPN蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)(例)

注：秩和檢驗(yàn)

2.3 sLAG-3蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá) sLAG-3在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同患者的胃癌分期、浸潤深度以及分化程度等有顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系(P<0.05)，見表3。

表3 sLAG-3蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)(例)

注：秩和檢驗(yàn)

2.4 DKK-1蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá) DKK-1蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系(P<0.05)，見表4。

表4 DKK-1蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)(例)

注：秩和檢驗(yàn)

3 討論

胃癌是我國比較常見的一種惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移以及侵襲是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究的結(jié)果表明，一半以上的胃癌患者在藥物治療以及手術(shù)治療之后，仍然死于腫瘤轉(zhuǎn)移或者是復(fù)發(fā)問題[7]。近年來分子生物學(xué)技術(shù)持續(xù)進(jìn)步，為胃癌轉(zhuǎn)移以及侵襲的分子學(xué)研究提供了基礎(chǔ)，研究人員在此基礎(chǔ)上探索同胃癌轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系的分子標(biāo)志物，從而及時預(yù)測并且綜合評估患者的預(yù)后，為臨床治療提供可靠指導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織OPN、sLAG-3以及DKK-1表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織以及正常胃黏膜組織(P<0.05)。OPN富含唾液酸，最早發(fā)現(xiàn)于骨基質(zhì)當(dāng)中，后續(xù)在人體的腎臟、消化道以及胎盤當(dāng)中發(fā)現(xiàn)。因?yàn)镺PN能在骨基質(zhì)以及細(xì)胞之間發(fā)揮橋梁作用，所以被成為骨橋蛋白[8]。OPN蛋白屬于細(xì)胞因子的一種，同時又是非膠原成分，含有同細(xì)胞黏附存在聯(lián)系的RGD(精氨酸-天冬氨酸)序列，并且可以借助于同受體以及整合素的結(jié)合刺激信號，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移以及增殖，參與到炎性反應(yīng)以及組織修復(fù)等過程[9]。臨床檢驗(yàn)結(jié)果顯示OPN在肺癌以及卵巢癌等腫瘤當(dāng)中的表達(dá)顯著上升，并且可以同受體結(jié)合來刺激腫瘤細(xì)胞的分化、增殖或者是浸潤。在人體的消化系統(tǒng)當(dāng)中，OPN主要存在于黏液細(xì)胞以及上皮細(xì)胞當(dāng)中，并且同胃癌發(fā)生以及發(fā)展存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，OPN蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。有研究人員對比胃癌患者以及健康人員的OPN含量，胃癌患者血清當(dāng)中的OPN水平明顯高于健康人群，同時集中在50～100 μg/L，這提示OPN高含量同胃癌發(fā)生有顯著正相關(guān)[10]。

sLAG-3屬于免疫球蛋白，能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示，在ADAMl0等蛋白酶類的影響下，LAG3的細(xì)胞膜表面跨膜區(qū)域肽鏈會出現(xiàn)斷裂，胞外位置脫落并且轉(zhuǎn)化成為可溶性的LAG-3也就是sLAG-3。sLAG-3可以同細(xì)胞分子互相作用，強(qiáng)化樹突狀細(xì)胞，并且在此基礎(chǔ)上激活CD4+以及CD8+細(xì)胞，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的效果[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sLAG-3在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同患者的胃癌分期、浸潤深度以及分化程度等存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。胃癌患者sLAG-3的整體含量明顯低于對照組，并且推測其含量的下降會影響到T細(xì)胞的激活，加大了癌細(xì)胞免疫逃逸，使得胃癌患者的病情惡化。

DKK-1屬于分泌蛋白家族，可以同Wnt-蛋白復(fù)合結(jié)合，從而影響到后者形成三聚體復(fù)合物，進(jìn)一步抑制Wnt信號通路。研究人員發(fā)現(xiàn)DKK1對于Wnt信號通路的影響同惡性腫瘤病情的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，并且能夠刺激癌細(xì)胞的侵襲以及增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，DKK-1蛋白在胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及胃癌分期等存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。研究人員分析胃癌患者的DKK-1表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)水平要明顯高于健康人群。這提示DKK-1的高表達(dá)能夠刺激胃癌的發(fā)生。綜合以上分析可以發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組織當(dāng)中的OPN水平以及DKK-1水平明顯上升，同時sLAG-3水平明顯下降，提示三者可以用來診斷患者并且評估患者病情的嚴(yán)重程度。

病理檢查是胃癌患者臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，常用的指標(biāo)包括分化程度以及TNM分期等。通過分析不同分化程度以及不同TNM分期患者胃癌組織當(dāng)中的OPN、sLAG-3以及DKK-1水平，結(jié)果表明I期、Ⅱ期患者以及高中分化患者的OPN、DKK-1水平明顯低于Ⅲ期、Ⅳ期患者以及低未分化患者，同時sLAG-3水平明顯高于Ⅲ期、Ⅳ期患者以及低未分化患者。這就表明三項(xiàng)指標(biāo)可以用來評估患者分化程度以及分期狀況。細(xì)胞凋亡可以說是程序性死亡的正常步驟，也是人體實(shí)現(xiàn)異質(zhì)細(xì)胞清除的作用途徑。胃癌病情惡化的過程當(dāng)中，OPN、sLAG-3以及DKK-1水平出現(xiàn)波動，會影響到細(xì)胞凋亡的過程，從而給病情發(fā)展創(chuàng)造條件，需要引起醫(yī)務(wù)人員的重視，在治療過程當(dāng)中動態(tài)監(jiān)測三者表達(dá)的變化，在此基礎(chǔ)上合理調(diào)整治療方案。

綜上所述，OPN、sLAG-3、DKK-1表達(dá)與胃癌分期、浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素存在密切聯(lián)系，能夠評估患者的病情及預(yù)后質(zhì)量。