劉玉洋，徐靖，何金宇，劉朋麗，史鈺軍，王慧中*，盧江杰*

(1.杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省珍稀植物藥工程技術研究中心，浙江 武義 321200； 4.浙江工商大學 外國語學院，浙江 杭州 310018)

鐵皮石斛和金釵石斛是2種被《中華人民共和國藥典(2015版)》收錄的蘭科石斛屬(Dendrobium)植物，兼具觀賞和藥用價值[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，石斛對咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病、腫瘤均具有顯著療效，特別是對人體肺癌細胞具有高達74.7%～97.2%的抑制率[2-3]。鐵皮石斛是珍稀瀕危藥用植物保護利用的典范，經(jīng)過二十多年的市場培育，已形成了集科研、種植、加工、銷售為一體的鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)。2016年浙江省鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達45億元，是全國產(chǎn)銷量最大的保健食品之一。金釵石斛是傳統(tǒng)中成藥石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及現(xiàn)代中成藥脈絡寧注射液、復方“清咽寧”等的重要配伍成分，同樣具有巨大的市場需求和經(jīng)濟價值[4]。由于市場需求巨大，一方面過度采挖導致野生石斛資源遭到破壞，而且石斛品種繁多，品質參差不齊；另一方面，集約化的栽培需要優(yōu)良的新品種。這就急需廣大科研工作者開展石斛新品種選育的相關研究。

雜交后形成的分離群體是親本遺傳圖譜構建、優(yōu)良性狀定位和相應性狀標記輔助育種的重要材料。雜交后代鑒定的方法主要有形態(tài)觀察鑒定[5]、細胞學鑒定[6]、同工酶鑒定[7]、分子標記鑒定[8]等，與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，分子標記技術對雜交后代進行鑒定能夠快速準確地鑒定出真雜交種，提高了育種效率。SSR分子標記具有共顯性、等位基因數(shù)量多、多態(tài)性高、重復性好、分析簡單等優(yōu)點[9]。謝文剛等[10]利用SSR分子標記技術對140個鴨茅雜交單株進行鑒定，利用3對特異引物可快速鑒定出雜交種111份。張自強等[11]對2個馬鈴薯雜交組合F1群體進行SSR鑒定，表明SSR分子標記技術用于馬鈴薯雜交種鑒定是可靠的。張冰清等[12]利用SSR分子標記技術對雜交油菜品種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)SSR技術鑒定結果與傳統(tǒng)田間鑒定方法結果一致，證明SSR標記可用于雜交油菜的鑒定。

作為中藥材，石斛種間雜交產(chǎn)生的后代在不清楚其藥用價值時，是不允許被用于生產(chǎn)的。但是在遺傳學研究中，種間雜交由于性狀差異明顯，往往比種內(nèi)雜交可以獲得性狀分離更加明顯的后代，從而有利于開展遺傳圖譜構建和優(yōu)良性狀定位。目前，對石斛的研究大多集中在有效成分、遺傳多樣性等方面，其雜交群體的創(chuàng)制、遺傳圖譜的構建、以及重要性狀的QTL定位研究較少。本研究利用SSR分子標記技術對鐵皮石斛和金釵石斛的雜交F2代群體進行雜種鑒定，通過構建有效的種間雜交分離群體，進而開展鐵皮石斛和金釵石斛的遺傳圖譜構建，石斛多糖和石斛堿等活性成分的QTL定位。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的雜交父本鐵皮石斛(♂)為金華壽仙谷藥業(yè)有限公司育成的仙斛1號(認定編號：浙認藥2008003)，雜交母本金釵石斛(♀)為浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室從云南收集的野生種質。從2010年開始進行雜交，2011年獲得雜交F1代，2014年雜交F1代自交，2015年獲得F2代分離群體。從F2代中隨機挑選131個單株作為本試驗的研究對象。摘取適量嫩葉片，放入-70 ℃冰箱中保存，以用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 雜交后代基因組DNA提取

用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)提取石斛基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠檢驗純度，用紫外分光光度計(NanoDrop2000)檢測濃度，并將各DNA樣品稀釋至20 ng·μL-1，4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 SSR引物篩選

浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室開發(fā)的320對石斛屬SSR引物[13]，由上海生工生物公司合成。以金釵石斛和鐵皮石斛基因組DNA作為模板，對引物進行初步篩選，條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的SSR引物用于后續(xù)實驗。

1.2.3 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應體系：總體積10 μL，10×Buffer(含Mg2+)1 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.3 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，Taq酶(2 U·L-1)0.5 μL，DNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 6.2 μL(PCR試劑均來自北京鼎國公司)。

聚合酶鏈式反應程序如下：在Thermal Cycler T100 PCR儀中，94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，各引物退火溫度下復性40 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.2.4 PAGE膠電泳檢測

將矩形玻璃板和凹形玻璃板洗凈并擦干后，用夾子分別夾住玻璃板兩端，水平放置。在燒杯中加入8%丙烯酰胺40 mL，10%過硫酸銨280 μL，TEMED 26 μL，搖勻后水平灌膠，排除氣泡，立即插上68孔梳子，放置30 min。將玻璃板放到電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)中，向電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液，拔出梳子，取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻，上樣。恒定電壓180 V電泳分離1.5 h。電泳結束后，將聚丙烯酰胺凝膠用蒸餾水漂洗2次。加入800 mL 0.1%的AgNO3溶液染色20 min，用蒸餾水漂洗2次。加入800 mL顯影液(12 g氫氧化鈉溶液，0.152 g四硼酸鈉)和1 mL甲醛，當凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶后用蒸餾水漂洗10 s。取出凝膠至顯影燈上，拍照。

2 結果與分析

2.1 石斛基因組DNA檢測

用1%的瓊脂糖凝膠檢測石斛基因組DNA純度，取5 μL提取的石斛基因組DNA溶液和1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻后點樣，標準DNA分子量選用15 K Marker(北京全式金公司)，D260/D280在1.8～2.0，無蛋白質、RNA污染，電泳結果如圖1。

2.2 石斛SSR引物篩選結果

從320對SSR引物中初步篩選出57對條帶清晰、有差異的引物用于后續(xù)石斛雜交群體的鑒定(圖2)。

2.3 SSR引物帶型分析

從57對SSR引物中篩選出3對特異性SSR引物可用于石斛雜交群體F2代真雜交種的鑒定。3對SSR引物詳細信息見表1。

29～1 147分別表示圖中所示27對引物來源于篩選所得57對可用于雜交后代多態(tài)性鑒定的引物圖2 部分引物的篩選電泳

名稱SSR上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')大小/bpDNtSSR013(AAACA)4GCCAAATTTCCTCCCAAAATGCAAGATGGGCTATGGTGAT255DNtSSR147(CTCCGA)4ACGAAGACGGTTCACTCCACCACGAGAGACTTCCAGAGGC176DNtSSR150(CCG)7AATGATGGCGGTCGATACTCTGCAGTGTCAAAGGTACCCA220

通過電泳圖分析(圖3)，我們將雜交群體單株的帶型分為真雜交種型、父本型、母本型、缺失型[11]。同時具有父本和母本一條或一條以上特征帶型的為真雜交種；與母本帶型相同的為母本型；與父本帶型相同的為父本型；與父本或母本帶型相似但缺失部分條帶的為缺失型。若雜交群體F2代中單株帶型為真雜交種型，可認定為真雜交種；若雜交種的帶型為缺失型、父本型或母本型，則需要用其他引物進一步判斷。

2.4 石斛雜交群體F2代真雜交種的鑒定

A，真雜交種型；B，母本型；C，父本型；D，缺失型圖3 SSR引物圖譜的帶型

引物DNtSSR013、DNtSSR147、DNtSSR150對石斛雜交群體F2代擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳如圖4～6。

M表示；1～131分別表示從F2代中隨機挑選的131個單株。圖5～6同圖4 DNtSSR013對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代(1-131)的擴增電泳

圖5 DNtSSR147對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代的擴增電泳

圖6 DNtSSR150對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代的擴增電泳

利用篩選出的3對引物對鐵皮石斛、金釵石斛2個親本及131個雜交群體F2代進行鑒定。首先用引物DNtSSR013進行鑒定，在250～280 bp處共有3條帶，母本有2條特征帶，父本有1條特征帶，在雜交群體F2代中同時具有父本、母本特征帶的有85個單株，鑒定為真雜交種。剩余的46個單株中有19個單株為父本型，27個單株為缺失型，因為用一對引物鑒定石斛雜交群體有其局限性，這些無法鑒定為真雜交種的單株需要用其他引物進一步進行鑒定(圖4)。其次用引物DNtSSR147對雜交群體F2代進行鑒定，在160～180 bp處共有3條帶，母本有1條特征帶，父本有2條帶，在剩余的46個單株中同時具有父本、母本特征帶的有8個單株，鑒定為真雜交種(圖5)。最后利用引物DNtSSR150進一步鑒定，在200～250 bp處共有3條帶，母本有1條特征帶，父本有2條特征帶，從剩余的38個單株中鑒定出26個單株同時具有母本、父本的一條特征帶，鑒定為真雜交種(圖6)。

利用引物DNtSSR013、引物DNtSSR147和引物DNtSSR150三對特異性SSR引物從131個雜交群體F2代中共鑒定出119個單株為真雜交種，真雜交種單株占雜交群體總數(shù)的91%，因此利用SSR標記對石斛雜交群體進行真雜交種的鑒定是可行的。在雜交群體F2代中個別單株出現(xiàn)父母本都不具有的新條帶，分析其原因可能是在配子形成過程中，減數(shù)分裂時同源染色體發(fā)生配對和交換或在染色體復制過程中部分堿基發(fā)生基因突變引起的[10]。

3 小結與討論

本研究從320對SSR引物中篩選出了3對特異性SSR引物用于鐵皮石斛、金釵石斛2個親本和131個雜交F2代單株真雜交種的鑒定。DNtSSR013、DNtSSR147和DNtSSR150三對特異性引物將雜交群體擴增帶型分為真雜交種型、母本型、父本型、缺失型，并從131個雜交群體F2代中鑒定出119個真雜交種，真雜交種占雜交群體的91%。通過多對SSR引物組合能夠快速準確的鑒定出真雜交種，因此利用SSR分子標記技術鑒定石斛雜交群體是可行的，提高了檢測的準確度，并為鐵皮石斛和金釵石斛的遺傳圖譜構建，石斛多糖和石斛堿等活性成分QTL定位奠定了基礎。