李昱瑩，郭麗麗，廉小芳，郭大龍，侯小改*

(河南科技大學 a農(nóng)學院，b林學院，河南 洛陽 471000)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)屬芍藥科芍藥屬，多年生落葉亞灌木，是我國特有的植物[1]，主要分布于我國中部、西南部至西北部[2-3]。自古以來，牡丹象征著國家繁榮興盛，民族幸福吉祥。具有很高的觀賞、食用，以及藥用價值。國家衛(wèi)生部監(jiān)督局于2011年3月指出可將油用牡丹鳳丹和紫斑作為新型木本糧油植物資源進行開發(fā)和利用[4]。牡丹籽油已逐步發(fā)展成我國重要的食用油，與其他油料作物相比，具有高產(chǎn)出(667 m2綜合效益達萬元)、高含油率(籽含油率≥22%)、高品質(zhì)(不飽和脂肪酸含量高于90%，α-亞麻酸高達42.8%，脂肪酸比例均衡)、低成本(耐旱耐寒耐貧瘠)等特點。因此，大力推廣油用牡丹的種植對促進我國糧油生產(chǎn)、改變食用油消費結構以及保障國家糧油安全均具有重要意義，其發(fā)展前景非常廣闊。

牡丹的有性繁殖為種子繁殖，但播種后代存在分離變異，不能較好地保存母本優(yōu)良性狀[5]，且其種子存在生理后熟和二次休眠現(xiàn)象，導致播種育苗周期較長[6]；其無性繁殖主要是分株、扦插、壓條、嫁接等[7]，但存在繁殖系數(shù)低、成苗周期長、出苗量少且質(zhì)量參差不齊等問題。與傳統(tǒng)育苗技術相比，組織培養(yǎng)技術有利于牡丹育種和快速繁殖[8]。因此，通過組織培養(yǎng)技術解決牡丹常規(guī)繁殖過程中存在的問題，將是油用牡丹發(fā)展走向商品化和產(chǎn)業(yè)化的必然趨勢[9]，也是加速其繁殖和育種的有效措施。

牡丹組織培養(yǎng)可在較短時期內(nèi)擴繁大量優(yōu)良品種，并能利用遺傳轉(zhuǎn)化技術在短期內(nèi)培育牡丹新品種[10]，可以在一定程度上打破傳統(tǒng)育種技術固有的局限性。時至今日，關于牡丹組織培養(yǎng)的研究主要集中在愈傷組織誘導、適宜生長調(diào)節(jié)劑配比、外植體選擇以及培養(yǎng)基完善等方面，但是牡丹快速繁殖(即微繁殖)體系尚未被確定，因此仍然無法滿足牡丹新品種培育和優(yōu)良品種推廣栽培的要求。此外，組織培養(yǎng)過程中仍存在污染嚴重、繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)褐化以及玻璃化現(xiàn)象、生根困難、移栽成活率低等問題亟待解決[11]。本文從外植體選擇及分化途徑，影響增殖和生根的主要因素等幾個方面概述了近年來牡丹組織培養(yǎng)的研究進展，同時論述了組織培養(yǎng)過程中污染、褐化以及玻璃化等問題出現(xiàn)的原因及其可能的解決方法，以期為今后開展牡丹組織培養(yǎng)新技術的研究奠定基礎。

1 牡丹再生體系研究

1.1 外植體的選擇及分化途徑

外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)過程中最重要的一步，近年關于牡丹的組織培養(yǎng)方面，國內(nèi)外研究學者均有大量報道[12]?？晒┻x擇的外植體種類繁多，其中主要有芽、莖尖和莖段、胚和胚珠、葉片和葉柄、花藥和花絲等，但不同外植體具有不同的分化能力，同一外植體的采摘時間和處理方式不同，其誘導的結果也不同。另外，不同的發(fā)生途徑對外植體也有一定要求，因此將外植體選擇與發(fā)生途徑結合起來，才能建立正確有效的組培體系。

1.1.1 外植體的選擇

牡丹組織培養(yǎng)的研究開始于1965年。隨后Bouza等[13]發(fā)現(xiàn)了選擇牡丹葉和腋芽組培最有效的細胞分裂素，從而推動了國內(nèi)外對于全方位了解牡丹組培的高潮。在國內(nèi)，李玉龍等[14]最早開展了牡丹組織培養(yǎng)技術的研究，其主要研究青龍臥墨池和十八號兩個品種不同外植體的誘導情況?，F(xiàn)階段關于建立牡丹無菌體系的研究大都集中在外植體類型、取材時間、品種以及消毒方式4個方面。

外植體類型。自從德國植物生理學家和植物學家Haberlandt提出了植物細胞全能性的概念之后，組織培養(yǎng)作為一種高效的植物快繁技術顯示出了巨大的應用價值，即任何外植體都具備在適當條件下誘導生成完整植株的能力。但研究表明，同一植株的不同外植體在器官發(fā)生能力上呈現(xiàn)出較大的差異。有研究表明，在牡丹組織培養(yǎng)過程中，土芽和幼芽的誘導率最高，葉片、葉柄次之，心皮和雄蕊卻未能誘導成功[15]。

外植體取材時間。關于牡丹芽取樣時間的研究表明，2月份獲取的外植體進行培養(yǎng)時，污染率低，萌發(fā)時間早，植株健壯，培養(yǎng)效果最好；相反，8—10月的外植體在誘導時不僅極易污染，而且萌芽緩慢，后期葉片發(fā)黃且生長瘦弱，容易出現(xiàn)褐化死亡等現(xiàn)象[16-17]。這是因為此時的外植體尚未經(jīng)歷休眠，芽體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)少；且對2月份取材而言，冬季的自然低溫可將土壤及植株上已附著的病菌、細菌等微生物凍死，從而減少了外源污染；另外，冬季自然低溫致使植株及芽內(nèi)的激素含量產(chǎn)生動態(tài)變化，例如IAA、GA3等促進萌發(fā)和生長的激素類含量增加，ABA等抑制萌發(fā)和生長的激素類含量減少[18]，從而改善了芽外植體的培養(yǎng)效果。

關于不同時期的花藥誘導愈傷組織的研究結果表明，不同時期的花藥誘導率也不盡相同，單核中期花藥誘導率最高，其次是單核晚期，而單核早期和雙核期均明顯低于單核晚期[19]?？赡艿脑蚴钱敾ㄋ幇l(fā)育到四分體時期時，還沒有發(fā)育完全，此時并不適合用來誘導愈傷組織。當達到單核中期時，細胞的生命活力最強，供給的營養(yǎng)也較為充沛，且細胞馬上開始有絲分裂，因此對誘導條件最為敏感，此時的花藥細胞極易發(fā)生染色體軸向的改變[20]，從而進入脫分化分裂，導致單核中期花藥最易產(chǎn)生愈傷組織。

外植體品種。研究發(fā)現(xiàn)，不同觀賞品種的牡丹，其誘導結果會存在一定的差異。當以豆綠、黑花魁、大胡紅和金星雪浪為材料進行叢生芽誘導時[16]，前兩者增殖系數(shù)較高、誘導分化出的叢生芽數(shù)量較多，而后兩者的增殖系數(shù)卻相對較低。各個品種之間誘導差異顯著，一些品種極易體外培養(yǎng)成活，一些品種出現(xiàn)褐化、玻璃化現(xiàn)象而使成活率降低，還有一些品種表現(xiàn)出體外發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，并且這種基因依賴現(xiàn)象還會影響到后期的繼代培養(yǎng)表現(xiàn)[21]。由此可見，基因型的差異對牡丹組織培養(yǎng)的影響也較大。

消毒方式。外植體的消毒滅菌是組培技術中最重要的環(huán)節(jié)之一，不同品種、不同類型的外植體，其最適消毒方法均不同。常用的消毒劑有0.1%～0.2% HgCl2[22]、70%～75%無水乙醇[11]、次氯酸鹽[23]等。一般的滅菌程序均為先對新鮮采集的外植體進行表面基本滅菌，然后利用合適的消毒劑消毒，最后用無菌水沖洗殘留消毒劑。有的外植體消毒困難，會有二次或多次滅菌[17]。

唐豆豆等[22]研究表明，使用0.1% HgCl2對鳳丹根蘗芽與鱗芽消毒8 min時，效果最好；而消毒過程持續(xù)超過10 min時，消毒劑對外植體本身的傷害較大，導致后期苗成活率較低。另外有研究表明，最好的消毒方式是直接使用升汞消毒[24]，但也有人認為無水乙醇與升汞交替使用效果最佳[25]。對牡丹而言效果最好的消毒方式是75%無水乙醇浸泡40～50 s，無菌水清洗后用0.2%升汞消毒 6～8 min[26-27]。不過也有研究表明，使用生物殺菌劑處理牡丹鱗芽時能達到100%消毒，且對材料無傷害，優(yōu)于使用HgCl2消毒[28]。此外消毒方式可以間接影響組培苗的褐化現(xiàn)象，研究顯示，與使用升汞消毒相比，使用NaClO會導致外植體的褐化程度加深[23]。

1.1.2 腋芽萌發(fā)途徑

大多數(shù)進行組培快繁的植物，其外植體器官發(fā)生途徑均為腋芽萌發(fā)途徑，這種途徑是不經(jīng)過脫分化產(chǎn)生愈傷組織后再生，而是直接由其分生中心分化出植物器官，最終成長為完整的植株。腋芽萌發(fā)途徑能很好地保留母本的優(yōu)良性狀，雖然變異率小，但增殖率通常較低且繁殖系數(shù)不高。由腋芽萌發(fā)途徑建立的組培體系中，外植體部位和外植體的預處理是影響培養(yǎng)成功與否的關鍵因素。牡丹組培常用的芽有頂芽[29-30]、腋芽[31]、萌蘗芽[32-33]。大部分的研究認為，不同部位的芽的誘導率有明顯的差別，其中萌蘗芽[32]誘導能力最強，花芽分化能力最低，可能是萌蘗芽組織分化程度較低，導致其誘導增殖能力最強。另外低溫預處理離體芽尖[33]后，其萌發(fā)率及發(fā)育速率會再次提高，且低溫處理之后外植體污染率及褐化率明顯降低。

1.1.3 間接器官發(fā)生途徑

植物的間接器官發(fā)生途徑是指外植體在一定條件下經(jīng)過脫分化誘導后產(chǎn)生愈傷組織，而后再由愈傷組織分化出不定芽或不定根，從而形成完整植株。由于脫分化所形成的愈傷組織可在較短時間內(nèi)重新誘導分化出大量新生植株，因此，通過誘導愈傷組織，可使外植體的繁殖系數(shù)大量增加，完成快速擴繁。但愈傷組織細胞團的遺傳性質(zhì)是不穩(wěn)定的，而且隨著繼代時間的增長，它們的分化再生能力會逐漸下降，甚至完全消失。近年來關于牡丹組織培養(yǎng)的研究也有以此途徑誘導再生植株的案例，在愈傷組織誘導過程中，外植體類型、培養(yǎng)基種類、激素配比和培養(yǎng)條件均對培養(yǎng)結果有不同程度的影響。目前，牡丹組培中愈傷組織誘導常用的外植體有莖尖和莖段[34-38]、葉片和葉柄[39-41]、花藥和花絲[42-43]、種胚[44-45]、根韌皮部[46]等。研究表明，牡丹不同外植體誘導出的愈傷組織存在高度異質(zhì)性[47]。

近年來，以牡丹莖尖為材料進行的組織培養(yǎng)也取得了一些進展。李志軍等[34]用大胡紅莖尖進行實驗時發(fā)現(xiàn)，30 d后每小段的簇生芽可達4～6個，說明其莖尖分化能力較強。隨后，在不同牡丹品種莖尖和莖段[10，35]誘導實驗中進一步證明，莖尖分化能力較強。研究發(fā)現(xiàn)，適合愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1BA+0.01 mg·L-1NAA。另外，研究學者也進行了大量的不同品種牡丹莖段誘導愈傷的研究實驗[36-37]，研究結果發(fā)現(xiàn)，以莖段為外植體誘導愈傷組織時易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。朱向濤[38]用江南牡丹莖段誘導愈傷組織時發(fā)現(xiàn)在愈傷組織分化過程中，加入0.2 mg·L-1KT效果最好，除此之外有機物的增加也有助于促進愈傷組織分化，其中以加入300 mg·L-1水解酪蛋白效果為最佳。

葉片是植物進行光合作用的重要營養(yǎng)器官，而葉柄是莖段培養(yǎng)的重要材料，二者作為外植體可加速良種植物的保存，解決不能用種子繁殖或難以用種子保存的種質(zhì)資源保存[48]。安佰義[39]用無葉柄幼葉作為外植體誘導愈傷組織，研究MS，B5和WPM 3類培養(yǎng)基的適用性，結果發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基更適用于該外植體愈傷組織的誘導。李麗霞等[40]以大胡紅和荷花紫的幼葉為外植體，用水解酪蛋白和4種植物生長調(diào)節(jié)劑(BA、2,4-D、KT、NAA)誘導愈傷組織，結果發(fā)現(xiàn)愈傷組織對2,4-D最為敏感。張健欣[41]分別以紫斑牡丹的大田和無菌苗葉片、葉柄為材料，研究NAA在愈傷組織誘導中對其誘導率的影響，結果表明，葉片和葉柄誘導愈傷組織時NAA的最佳濃度為0.3 mg·L-1和0.4 mg·L-1；另外不同外植體愈傷組織誘導率表現(xiàn)出明顯的差異，誘導愈傷的能力水平為無菌苗葉柄>大田葉柄>無菌苗葉片>大田葉片。

牡丹具有多核或多細胞花粉，說明其具有良好的誘導潛力，因此花粉誘導是獲得單倍體和純合體的有效途徑[49]。當前，對于牡丹花藥和花粉培養(yǎng)仍停留在誘導出愈傷組織階段，并沒有誘導出完整植株，說明牡丹花藥和花粉培養(yǎng)還處于起步階段。朱向濤等[42]以鳳丹帶花絲的花藥為材料誘導愈傷組織時發(fā)現(xiàn)單核中期為其取材的最佳時期，在4 ℃低溫條件下對外植體進行預處理后，其愈傷組織誘導率可達50.8%。劉會超等[43]以烏龍捧盛花藥為外植體，研究不同培養(yǎng)基和激素組合對其愈傷組織誘導率的影響中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基為最佳，Miller培養(yǎng)基次之，B5培養(yǎng)基則較差，其誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+2 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-BA+0.5 g·L-1水解乳蛋白。

胚培養(yǎng)是指無菌條件下將植物的種胚接種在適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)育成苗的一種組織培養(yǎng)技術。該技術不僅可以減緩胚敗育和發(fā)育不良的情況，也可以縮短休眠期，加快種子發(fā)育、促進萌發(fā)，另外胚的離體培養(yǎng)可將萌發(fā)時間縮短28～42 d[50-51]。Demoise等[52]利用牡丹種子成熟胚成功地誘導出愈傷組織，使更多研究人員開始重視對牡丹的胚培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期的胚誘導愈傷組織的情況也有差異，幼胚分化程度低，其誘導率比成熟胚高[44]。激素的選擇在一定程度上也有很大的影響，在添加2,4-D和TDZ的培養(yǎng)基上，日本品種太陽已成功地由胚誘導出愈傷組織[53]。另外，H2O2等外源物質(zhì)的使用對牡丹胚的誘導也有促進作用[45]。

胚珠培養(yǎng)是指在無菌條件下培養(yǎng)子房中所取得的胚珠，使胚珠直接或通過誘導愈傷組織、不定芽、珠心及其他器官獲得試管苗[50]。胚珠培養(yǎng)具有縮短發(fā)芽時間，提高萌發(fā)率，保存雜交胚胎和加快育種的能力。2006年何桂梅等[54]首次報道關于牡丹胚珠培養(yǎng)的研究，指出花后48 d的胚珠很難培養(yǎng)，可能是因為沒有完成受精或在培養(yǎng)基中沒有足夠的營養(yǎng)物；花后60 d的胚珠(胚胎完全分化)在MS培養(yǎng)基中，可以發(fā)育成苗，但需要及時移除胚乳。

1.1.4 體細胞胚胎發(fā)生途徑

體細胞胚發(fā)生途徑最早是在針葉樹種離體培養(yǎng)研究中獲得的，一些木本植物現(xiàn)已成功建立了通過此途徑獲得再生植株的體系。目前，能成功誘導出體胚的牡丹品種很少，且誘導率普遍較低[55-65]。對于油用牡丹品種鳳丹的研究也僅在殷麗青等[44]和周秀梅[57]的論文中有所提及，但所提出的研究結果均顯示體胚誘導率極低，且大多數(shù)體胚誘導成功之后因不能繼續(xù)生長，導致后續(xù)實驗無法開展。由此可見，牡丹的體細胞胚誘導仍然較為困難。

BMD提供了支持定理1中對函數(shù)進行A變換的算術運算[12]，如A(xi∧xj)通過算術與實現(xiàn)，A(xi⊕xj)通過算術異或?qū)崿F(xiàn)，并且可以實現(xiàn)定義6中的“在A變換過程中利用冪等律抑制隨機變量的指數(shù)成分”.對函數(shù)f的邏輯表達式實施相應的算術運算即可得到A(f)對應的BMD，將隨機變量Xi的值代入，進行BMD求值[12]即可得到f的信號概率.BMD可以較高效率地表示和操縱類似于概率表達式的代數(shù)表達式，并且BMD求值的復雜度為線性復雜度[12]，因此本文在底層使用BMD表示概率表達式.

外植體的種類、基因型和前期預處理等均對體細胞胚的誘導有影響。王瑩等[58]把不同收獲期的紫斑種胚作為外植體進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，種子成熟度不同對組培苗的生長有一定影響。大部分研究表明，牡丹體細胞胚發(fā)生的最佳時期是花后90～110 d[59]。朱向濤等[60]用合子胚、胚軸和子葉作為外植體進行培養(yǎng)，從而探究不同外植體的誘導情況，結果表明，種胚的誘導率最高。Brukhin等[61]研究發(fā)現(xiàn)，以球形胚階段后的胚狀體為外植體時，其繁殖能力最強；而心形胚和魚雷形胚只有25%能誘導成株；在誘導愈傷組織時，成熟種胚、魚雷形胚和心形胚的誘導率依次降低。另外，多數(shù)學者研究證明激素配比對體細胞胚誘導的影響也極為重要。

1.2 影響增殖的主要因素

1.2.1 培養(yǎng)基

由于牡丹基因型及外植體選擇的多樣性，其誘導過程中所選培養(yǎng)基種類也不盡相同。主要的基本培養(yǎng)基有B5[62]、LP[63]、N6、LM[64]、DCR[61]、MS[65-66]和WPM[67-68]培養(yǎng)基，牡丹組培中使用最普遍的培養(yǎng)基是MS及各種改良的MS培養(yǎng)基，也有用WPM作為基礎培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)基內(nèi)所含無機鹽、有機營養(yǎng)物以及外植體生長所需的碳源和氮源有所不同，其種類和成分直接影響到組培苗的生長[69]。

初代培養(yǎng)指外植體接種后最初的幾代培養(yǎng)，其目的是為了獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)常用誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的外源生長激素主要為細胞分裂素，生長素含量則相對較少。安佰義[39]在研究不同培養(yǎng)基作用于叢生芽誘導的實驗中，發(fā)現(xiàn)低溫處理后的外植體在WPM培養(yǎng)基上叢生芽誘導率最高，MS培養(yǎng)基次之，B5培養(yǎng)基最低。王新等[70]用鳳丹鱗芽培養(yǎng)時，也證實了WPM培養(yǎng)基誘導率最高。但也有研究顯示，初代培養(yǎng)基為MS時，外植體生長發(fā)育快，葉柄長；培養(yǎng)基為WPM時，其生長發(fā)育減慢，且葉柄較短[71]。馬俊[72]也表示，在牡丹的初代培養(yǎng)中，比較理想的培養(yǎng)基為鈣離子濃度加倍的MS培養(yǎng)基。也有人認為關于牡丹最適的初代培養(yǎng)基是半強度MS培養(yǎng)基[73-74]，其誘導叢生芽的效果顯著優(yōu)于MS基本培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)是指在初代培養(yǎng)獲得無菌材料后再進行的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。其目的是為了得到一定數(shù)量的無根苗，然后用獲得的無根苗邊繁殖邊生根，其后代數(shù)量按幾何級數(shù)快速增加。繼代培養(yǎng)基通常選用分化培養(yǎng)基，而且不同外植體在繼代時所需要的培養(yǎng)基也不同。王燕霞等[75]以洛陽紅為試材研究6種不同培養(yǎng)基(MS、1/2MS、C17、WPM、B5、DKW)對繼代苗增殖生長的影響時發(fā)現(xiàn)，DKW培養(yǎng)基最適合其繼代增殖。孟清秀等[76]研究表示，牡丹品種菱花湛露的最佳增殖培養(yǎng)基為改良WPM培養(yǎng)基。張桂花等[30]通過對豆綠、大胡紅、黑花魁和金星雪浪的鱗芽進行培養(yǎng)研究，認為MS為最佳繼代培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)的周期同樣也對牡丹組織培養(yǎng)產(chǎn)生影響，多數(shù)研究表明，在第3～4周，牡丹組培苗的質(zhì)量最佳，生長量大；第4～5周，組培苗生長量增加不大，但不定芽可以充分生長。因此，牡丹組織培養(yǎng)以4或5周為繼代周期較好[77-78]。

植物組織培養(yǎng)過程中生長調(diào)節(jié)劑的配比非常重要，直接影響苗和根的形成[79]。不同植物在不同生長階段其所需要的生長調(diào)節(jié)劑種類和配比均不相同，另外，不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比不同，其誘導效果也不同，其中生長素和細胞分裂素的使用起著至關重要的作用。牡丹組培常用的生長素有NAA、2,4-D、IAA、IBA；細胞分裂素有6-BA、KT、TDZ、ZT。另外，赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)在牡丹組織培養(yǎng)中也很重要。

不同種類的細胞分裂素在牡丹組織培養(yǎng)過程中的影響不同，大量實驗研究表明，6-BA[80-81]是對牡丹葉芽最為重要的細胞分裂素，與其他激素同時使用效果會減弱，在增殖培養(yǎng)中只有6-BA能促進不定芽的發(fā)生。隨后更多的實驗證實，6-BA和GA3同時使用效果較單獨使用6-BA更好，但在低鈣濃度下會出現(xiàn)莖尖和葉片枯死。因此，不能長時間使用同時含有6-BA和GA3的培養(yǎng)基，應盡可能地間斷使用[68]。另外6-BA、KT和TDZ單獨使用可促進牡丹腋芽發(fā)育[82-83]，但增殖率都比較低，低濃度的TDZ、6-BA和KT合用能顯著提高腋芽形成和叢生芽形成。另外不同激素組合可以對牡丹增殖系數(shù)產(chǎn)生較大差異的影響，研究人員利用極差分析結果表明，6-BA、KT、NAA 3種激素對增殖數(shù)的影響逐漸降低[35]。

生長素有利于營養(yǎng)器官伸長生長，可以使細胞進入持續(xù)分裂的增殖狀態(tài)。牡丹鱗芽增殖實驗表明，NAA對其影響比較顯著[84]；對于牡丹組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA的正向效果極其顯著[39]。在牡丹組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)生長素與細胞分裂素有協(xié)同作用，搭配使用時其濃度比例不同誘導效果也不同，一般來說細胞分裂素高時有助于芽的分化，細胞分裂素含量較低時，則有助于根的形成。

1.2.3 培養(yǎng)環(huán)境條件

除外植體及培養(yǎng)基種類之外，濕度、溫度、光照和pH值等因素也嚴重影響著牡丹組織培養(yǎng)結果的成敗?，F(xiàn)階段公認的最適合牡丹組織培養(yǎng)的環(huán)境條件如下：溫度為(25±1) ℃，光強為1 500～2 000 lx，光照時間是每天10～12 h，培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。

濕度是組培過程中一個較重要的因素，研究表明，將濕度控制在70%上下較為適宜[85]，因為過低會使培養(yǎng)基滲透壓升高，影響植株健康生長；過高則易造成污染。另外溫度的控制也很重要，研究發(fā)現(xiàn)24～26 ℃時,試管苗生長快、長勢壯、且芽分化多，表現(xiàn)最佳[30]。

光照因子對牡丹組培的影響較多，主要有光強、光質(zhì)、光照時間等，大部分的研究表明，光強為1 500～2 000 lx，光照周期為12 h的光照條件最佳。對于光質(zhì)的現(xiàn)有研究則表明，70%紅光+30%藍光的冷光燈處理35 d后，組培苗的葉片數(shù)、株高及莖長等均達到理想效果[86]。

1.3 影響生根的主要因素

生根是組培過程中非常重要的階段，受多種因素影響，包括培養(yǎng)基成分[87-88]和環(huán)境因素[89-90]。生根困難是牡丹增殖體系確定過程中最受關注的問題，包括生根質(zhì)量差以及體外培養(yǎng)存活率低[91]。因此，生根問題的解決將是牡丹組培中一個很重要的突破。

總結所有研究發(fā)現(xiàn)，牡丹組培苗誘導生根可分為 3種：(1)速蘸法，將組培苗浸泡在高濃度IBA溶液中，迅速接種到只含活性炭不加任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基上；(2)一步生根法，外植體誘導生根時在含有低濃度IBA的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)[22]；(3)兩步生根法，先將組培苗在含高濃度IBA的培養(yǎng)基上進行根誘導培養(yǎng)，然后在僅含有活性炭的培養(yǎng)基上生根。大量實驗證明，兩步法是目前為止最常用且效果最好的方法[92]。此外蔗糖濃度也嚴重影響組培苗的生根數(shù)量，充足的糖類化合物能提高牡丹組培苗的生根率，并同時促進根和莖的生長[93-94]。

牡丹內(nèi)含有大量的酚酸化合物，對其體外生根有一定的影響[95]。有報道稱酚酸在植物生物和非生物脅迫下積累[99]并控制不定根的形成和發(fā)展[96-97]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，牡丹組培苗中含有12種酚酸化合物，內(nèi)源性酚酸含量的變化與其體外生根密切相關，其中二元酚有利于體外生根[98]。

2 制約牡丹組織培養(yǎng)發(fā)展的主要因素

2.1 污染

污染現(xiàn)象在組培過程中經(jīng)常出現(xiàn)，且一旦出現(xiàn)污染就容易造成失敗。易引起污染的原因有很多，如接種人員以及外植體帶菌、操作環(huán)境及接種工具滅菌消毒不徹底、操作不規(guī)范、外植體內(nèi)生菌較多等等。因此，實驗過程需嚴格按照操作要求進行，杜絕接種前污染。組培室以及操作間需定期進行消毒，經(jīng)常用酒精噴霧降塵消毒，并用紫外線照射消毒滅菌。對于接種后的污染，要根據(jù)外植體種類的不同尋找不同的消毒方式進行預防，選擇合適的方法和消毒劑，適當情況下可進行多次滅菌。植物內(nèi)生菌導致的污染，則可在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素或適宜的抑菌劑，從而降低污染率。

2.2 褐化現(xiàn)象

褐化是組織培養(yǎng)中最重要的問題，其會引起外植體代謝紊亂，最終將導致死亡。外植體的品種、取材部位、年齡、取材時間以及培養(yǎng)基種類、組培室溫度等等均與褐化相關。研究表明，年齡老、高度分化、木質(zhì)化程度高的外植體材料很容易褐化，而較嫩、分化程度低的材料褐化程度相對較輕[99]。牡丹是多糖多酚植物，繼代時外植體基部愈傷被切除，切口處的酚類物質(zhì)會被氧化形成深褐色的醌類物質(zhì)，這些物質(zhì)在多酚氧化酶、酪氨酸酶等作用下，導致其他代謝通路不穩(wěn)定，最終使外植體衰老死亡。由于各個品種牡丹植株內(nèi)的總酚含量不同，因此關于影響牡丹褐化的因素，研究人員們做了大量研究。牡丹花型繁多，花型越復雜，越容易發(fā)生褐變，這是因為植株自身多酚氧化酶含量是隨花型演化程度的增加而增加的。而且溫度會影響多酚氧化酶的活性，研究表明，木本植物在溫度較低的冬春季取材褐化率較低；一般越小的外植體褐化越嚴重，故而選取適宜大小的外植體可有效降低褐化率。

另外培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及抗褐化劑的添加也會對褐化造成一定程度的影響。不同培養(yǎng)基添加的無機鹽離子濃度各不相同。牡丹葉柄培養(yǎng)常用的 3種培養(yǎng)基：WPM、1/2MS和MS培養(yǎng)基，其培養(yǎng)過程中外植體褐化程度依次加重[100]。因此，外植體褐化程度與培養(yǎng)基的無機鹽濃度呈正相關。在培養(yǎng)過程中適當?shù)牡蜏豙101]和黑暗[27]處理可以緩解褐化的發(fā)生，這是由于溫度和光照與多酚氧化酶的活性相關。此外在黑暗條件下，6-BA能引起多酚氧化酶活性提高，而2,4-D和IAA可以減少多酚合成[102]，所以適當?shù)募に嘏浔纫部梢詼p輕褐化發(fā)生。由于牡丹組織培養(yǎng)發(fā)生褐化是一種酶促反應，選擇合適的褐化抑制劑、抗氧化劑和吸附劑可以抑制酶的活性，從而使褐化程度降低。常用的有抗壞血酸(Vc)、AgNO3、Na2S2O3、PVP、活性炭(AC)。Vc可以將Cu2+還原為Cu，而后產(chǎn)生的螯合物可以抑制酶的活性；吸附劑對褐化的抑制作用為 PVP>AC[100]，且AC容易聚集在外植體傷口處，阻礙其吸收營養(yǎng)。

2.3 玻璃化現(xiàn)象

玻璃化是植物在組培過程中極易出現(xiàn)的生理病變或生理失調(diào)現(xiàn)象，多表現(xiàn)為葉片縱向卷曲或腫脹，表皮角質(zhì)層蠟質(zhì)缺少，葉片脆弱易碎；組培苗含水量高，存活率低。已報道80多種植物組培時出現(xiàn)玻璃化[103]。玻璃化的牡丹苗葉柄較粗，葉片肥厚，半透明狀，植株呈充水狀，與凍害植株形態(tài)極其相似。由于玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生將導致組培苗病變死亡，因此解決玻璃化現(xiàn)象將有利于提升組織培養(yǎng)技術的成功率。

2.4 生根困難和移栽成活率低

目前，牡丹組織培養(yǎng)體系建立過程中最難解決的問題仍在組培苗生根以及馴化移栽過程。因為牡丹組培苗生根率低且生根質(zhì)量差，且大多數(shù)不定根由愈傷產(chǎn)生，不定根與植株之間沒有直接連接，另外生根誘導過程中外源IBA的使用會導致植株內(nèi)源ABA大量積累，繼而導致植株分裂能力下降，出現(xiàn)休眠現(xiàn)象，所以移栽成活率低。為了建立合適的馴化移栽體系，研究人員作了大量的工作，包括組培苗生根狀態(tài)、移栽季節(jié)、基質(zhì)的選擇以及后期管理等方面的關鍵技術。研究證實，待生根后1個月，根長達到3～4 cm時移栽成活率最高[105]，主要是因為過早移栽植株適應力差，抵抗力弱；過晚移栽時根系木質(zhì)化程度大，吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力變差。移栽時應選擇晝夜溫差大、溫度適宜的秋季，以便移栽苗健康生長。

試管苗種植成活過程中另一個重要的因素就是基質(zhì)的選擇。一般而言，基質(zhì)的質(zhì)地要疏松透氣，同時有良好的保水性，還要容易消毒等。常用的基質(zhì)有蛭石粉、珍珠巖、草炭土、腐殖質(zhì)等。通常認為蛭石粉+草炭土(1∶1)更適宜組培苗生長[34]。

2.5 成本高

組織培養(yǎng)技術雖然在一定程度上可以縮短傳統(tǒng)育種年限，短時間內(nèi)獲得大量幼苗，達到一定經(jīng)濟效益，但總體來看，其成本仍然相對較高。無論是培養(yǎng)基、外植體、蔗糖等物資，還是人力的消耗，再加上組培苗成活率低、移栽困難等問題導致其處于高成本技術范疇。

3 組培新技術

常規(guī)的組織培養(yǎng)中，研究人員一直將重心放在培養(yǎng)基篩選、激素配比及外植體的種類選擇等方面。事實上光照、溫濕度、CO2濃度等對小植株生長的影響也很大，因此研究人員提出了關于組培的新技術：光自養(yǎng)培養(yǎng)技術/無糖培養(yǎng)技術，植物開放式組織培養(yǎng)以及開放式光自養(yǎng)微繁技術。

光自養(yǎng)培養(yǎng)技術(photoautotrophic micropropagation)又稱無糖培養(yǎng)技術(sugar-free micropropagation)，是指組織培養(yǎng)過程中改變碳源供給途徑，并控制環(huán)境因子，從而促進植株光合作用速率，使外植體生長由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型[106]。光自養(yǎng)培養(yǎng)技術不需要蔗糖為碳源，大量降低了雜菌的繁殖速率；且培養(yǎng)容器向大型化發(fā)展，降低了傳統(tǒng)培養(yǎng)中，容器較小，環(huán)境較密閉，瓶內(nèi)氣體不流通，相對濕度較高等問題；另外，傳統(tǒng)培養(yǎng)中多使用瓊脂等凝膠物質(zhì)為支撐材料，組培苗根系脆弱，馴苗困難，而該技術多使用塑料泡沫、蛭石、成型巖棉等多孔性無機材料，價格低廉且大多可重復使用，很大程度上降低了成本。而且這些材料通氣性好，可有效促進植株根系生長。目前，國內(nèi)外學者對于光自養(yǎng)培養(yǎng)技術的研究多集中在培養(yǎng)室環(huán)境[107-109]、培養(yǎng)容器大小[110-111]、CO2的輸入[112-113]、支撐材料[114]等等。研究表明，與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，光自養(yǎng)培養(yǎng)獲得的組培苗生長快且長勢較好，畸形苗少，生根率和成苗率較高。另外，培養(yǎng)過程中污染率大幅降低，使得試管苗馴化期間的成活率大幅上升。

植物開放式組織培養(yǎng)是指無需高壓蒸汽滅菌，在超凈工作臺外的操作環(huán)境用普通容器進行接種工作的新型技術，培養(yǎng)基中添加適量抑菌劑，可在自然開放的有菌環(huán)境中進行操作[115]。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，其從根本上簡化了操作環(huán)節(jié)，成本也極度降低、可大規(guī)模生產(chǎn)試管苗。關于開放式培養(yǎng)的研究多集中于抑菌劑的挑選上，這是因為整個操作過程不在無菌的條件下進行，污染便成了關鍵問題。崔剛等[116]運用中醫(yī)理論，從多種植物中提取了具有廣譜性殺菌、抗菌的物質(zhì)，并成功地建立了葡萄開放式組織培養(yǎng)體系。目前荸薺[117]、香蕉[118]、魔芋[119]、白菜[120]等植物均已成功建立了開放式組織培養(yǎng)技術體系，關于牡丹的相關技術則尚未見報道。開放式組織培養(yǎng)大力推動了組培苗工廠化發(fā)展，為今后研究提供了新思維。

開放式光自養(yǎng)微繁技術，就是將兩種新興技術結合在一起的方法，即在開放有菌的環(huán)境下，將外植體接種在含有合適抑菌劑，并且無糖的容器中。這一技術將兩個新興技術完美地融合在一起，既簡化了消毒過程，同時使組培室環(huán)境得到改善。但開放式光自養(yǎng)培養(yǎng)對植物生長、發(fā)育的影響研究還比較有限詳細，尚未見成熟技術體系的報道。

4 展望

關于牡丹組織快繁的研究一直是牡丹研究人員關注的重點，這對于保存優(yōu)良牡丹品種，縮短育種年限以及提高存活率有極大的幫助。雖然還沒有呈現(xiàn)出一個完整的技術體系，但已經(jīng)有了較成熟的基礎。比如關于牡丹組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的褐化、玻璃化、生根困難等問題均已得到一定程度的解決，研究人員的關注點也不再局限于基礎的激素配比上，更多的集中于體細胞培養(yǎng)以及分生結節(jié)誘導方面，進而從根本上解決牡丹愈傷分化能力的問題。

隨著組織培養(yǎng)技術的快速發(fā)展，我國牡丹組織培養(yǎng)技術的研究應在原有的基礎上放寬視野，可進一步針對牡丹組織培養(yǎng)進行新技術的研究，從而加快工廠化的推進，或與轉(zhuǎn)基因技術和分子技術相結合，從而致力于與抗性、花期、花色等優(yōu)良性狀相關的牡丹品種的研究。另外，牡丹的藥用價值也是關注重點，可通過多學科技術的結合，深層次地掌握其代謝途徑。