毛黎娟，章初龍

(浙江大學(xué) a農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心,b生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

真菌在谷物或其他食品中生長(zhǎng)繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生真菌霉素，當(dāng)人或動(dòng)物食入這種霉變的谷物或食品時(shí)發(fā)生中毒現(xiàn)象，即為真菌性食物中毒。真菌毒素是食品鏈中的隱形殺手，著名的真菌毒素有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素。

膠霉毒素是煙曲霉產(chǎn)生的真菌毒素之一[1-6]，具有免疫抑制活性和抗菌活性。除了煙曲霉以外，青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma)等很多真菌都可以產(chǎn)生膠霉毒素。歐盟302/2 014號(hào)法規(guī)批準(zhǔn)由里氏木霉菌株CBS 126896生產(chǎn)的內(nèi)切-1,3(4)-β-葡聚糖酶制備物可作為飼料添加劑使用，但加拿大等規(guī)定產(chǎn)真菌毒素的生產(chǎn)菌不能用作飼用酶制劑生產(chǎn)菌。同時(shí)，木霉還是常用的植物病害生防真菌，一些木霉種，如綠木霉(T.virens)會(huì)產(chǎn)生膠霉毒素[7]。但迄今關(guān)于在農(nóng)作物上使用生防木霉菌是否會(huì)導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中膠霉毒素殘留仍未明確。因此，建立膠霉毒素的定量分析方法對(duì)于檢測(cè)谷物或食品中的膠霉毒素殘留，以及分析真菌產(chǎn)膠霉毒素的能力等都是非常必要的。

Romer Labs@建立了針對(duì)膠霉毒素的基于薄層層析(TLC)的定量檢測(cè)方法，可用于谷物、飼料等樣品中膠霉毒素的半定量檢測(cè)，國(guó)內(nèi)也有研究人員對(duì)人體細(xì)胞和煙曲霉共培養(yǎng)液中的膠霉毒素進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)產(chǎn)膠霉毒素的真菌菌株進(jìn)行分離鑒定等，但還未見(jiàn)對(duì)糧食或蔬菜中膠霉毒素進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。為此，擬建立適合于黃瓜中膠霉毒素殘留檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)定量分析方法，以期為相關(guān)研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材與儀器試劑

供試材料為市售黃瓜。

儀器：Delta 600高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；Tissuelyser-24全自動(dòng)樣品快速研磨儀，中國(guó)上海凈信科技；3K15臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma；分析天平，中國(guó)上海梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗器，中國(guó)上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

試劑：甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)Sigma；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

膠霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Romer Labs@，濃度101.0 μg·mL-1，4 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取1.0 mL置于10.0 mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液(含膠霉毒素10.10 μg·mL-1)。

1.2.2 供試品處理

取黃瓜500 g，去蒂。將可食用部分切碎，用組織粉碎機(jī)將樣品加工成漿狀，均勻分成若干份，分裝入潔凈盛樣袋內(nèi)，密閉，標(biāo)記。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g均勻試樣置于5 mL的具塞刻度塑料離心管中，準(zhǔn)確加入2.0 mL 84:16(體積比)乙腈-水溶液，加入5顆陶瓷珠，用全自動(dòng)樣品快速研磨儀65.00 Hz快速提取180 s，重復(fù)提取4次。先以9 000 r·min-1離心15 min，取上清，再以12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，即得供試品溶液。

1.3 液相色譜條件

分析柱：XBridge C18，內(nèi)徑5 μm，4.6 mm×250 mm(寬pH值范圍)，柱溫35 ℃；流動(dòng)相：A相為水，B相為甲醇。梯度洗脫程序：0 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比50∶50；15.00 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比50∶50；15.10 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比25∶75；20.00 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比10∶90；25.00 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比50∶50；35.00 min，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比50∶50。檢測(cè)條件：流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)器為Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器。

1.4 測(cè)定方法

取對(duì)照品溶液及供試品溶液20 μL進(jìn)行液相色譜分析，記錄色譜圖。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中膠霉毒素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑

分別選用84∶16(體積比)的乙腈-水溶液與70∶10∶20(體積比)的甲醇-水-正己烷溶液提取黃瓜中的膠霉毒素。結(jié)果顯示，在相同質(zhì)量的黃瓜中加入相同體積的提取溶劑，都能滿(mǎn)足提取需要，但是甲醇-水-正己烷溶劑體系不互溶，增加了操作步驟；因此，本試驗(yàn)采用84∶16(體積比)的乙腈-水溶液作為提取溶劑，進(jìn)行膠霉毒素提取。

2.2 色譜條件

2.2.1 流動(dòng)相比例

流動(dòng)相由甲醇和水組成，隨甲醇濃度的增加，膠霉毒素保留時(shí)間減小。如果膠霉毒素濃度太大，與雜質(zhì)峰不能實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離；如果膠霉毒素濃度太低，則峰寬變大，保留時(shí)間太長(zhǎng)。本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相比例、濃度、流速等條件進(jìn)行篩選，最終采取梯度洗脫的方法。在該梯度條件下，雜質(zhì)峰和膠霉毒素色譜分離良好，且可減少數(shù)據(jù)采集時(shí)間，保護(hù)色譜柱。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

以10.10 μg·mL-1膠霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3節(jié)的流動(dòng)相條件下在210～400 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，最大吸收峰為269 nm。故采用269 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量分析(圖1)。

A，檢測(cè)波長(zhǎng)210～400 nm的檢測(cè)結(jié)果；B，出峰時(shí)間為9.348 min 時(shí)210～400 nm的檢測(cè)圖譜；C，出峰時(shí)間為9.348 min、 269 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的HPLC色譜圖1 膠霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)圖譜

2.3 專(zhuān)屬性

在上述試驗(yàn)條件下，經(jīng)預(yù)處理的黃瓜樣品中其他物質(zhì)不干擾膠霉毒素的測(cè)定(圖2)，可見(jiàn)該方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系

分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相作為稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)⑴渲颇z霉毒素濃度分別為0.101、0.202、0.505、1.01、2.02、5.05、10.1 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程為Y=9788.9X+537.45，R2=0.997 9。結(jié)果表明，膠霉毒素在0.101～10.10 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 檢測(cè)限和定量限

以3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢測(cè)限，以10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度作為定量限，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)方法的檢測(cè)限與定量限分別為0.101、0.202 μg·mL-1，相當(dāng)于取樣量為0.5 g時(shí)，樣品中對(duì)應(yīng)的膠霉毒素含量分別為0.4、0.8 mg·kg-1。

A、B、C、D分別為空白、對(duì)照、樣品和樣品加標(biāo)圖2 黃瓜中膠霉毒素的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果

2.6 精密度

分別取對(duì)照品溶液0.101、1.01、5.05 μg·mL-1，按照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定5次，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)，平均值為2.5%，表明膠霉毒素測(cè)定精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性

取新制備的0.101、1.01、5.05 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，室溫下棕色瓶中密封避光保存，分別保存0、4、12、16、36、42、124、130 h進(jìn)樣(表1)，檢測(cè)結(jié)果的RSD分別為3.3%、3.4%、2.1%，表明膠霉毒素溶液穩(wěn)定性良好，但盡快進(jìn)樣的測(cè)定結(jié)果更可靠。

表1 膠霉毒素的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性

分別稱(chēng)取同批次黃瓜約0.5 g，加入膠霉毒素對(duì)照品溶液(膠霉毒素濃度為101 μg·mL-1)10.0 μL，制成含1.01 μg的樣品，按1.2.2節(jié)方法平行制備6份供試品溶液，按照1.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的膠霉毒素含量分別為2.033 7、1.952 3、2.191 7、2.115 2、1.998 2、2.180 0 mg·kg-1，計(jì)算樣品膠霉毒素含量的RSD為4.8%。

2.9 回收率

取無(wú)膠霉毒素殘留的黃瓜空白樣品各0.50 g，分別加入膠霉毒素對(duì)照品溶液(膠霉毒素濃度為101 μg·mL-1)5.0、10.0、20.00 μL，制成含低中高3種濃度的樣品，每個(gè)濃度樣品平行3份，按照前述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。黃瓜中膠霉毒素的平均回收率分別為106.3%、103.2%和105.5%，RSD分別為1.4%、3.7%和5.0%(表2)，符合檢測(cè)要求，可滿(mǎn)足黃瓜樣品中含低中高濃度的膠霉毒素殘留的檢測(cè)要求。

表2 黃瓜樣品中膠霉毒素加標(biāo)回收率及精密度

3 小結(jié)

建立黃瓜中膠霉毒素的HPLC定量分析方法，與Romer Labs@建立的膠霉毒素TLC定量檢測(cè)方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)，能較準(zhǔn)確地測(cè)定膠霉毒素殘留量。該方法測(cè)定黃瓜中膠霉毒素含量的線(xiàn)性范圍為0.101～10.1 μg·mL-1，檢測(cè)限為0.101 μg·mL-1，回收率99.5%～108.6%，對(duì)黃瓜樣品進(jìn)行測(cè)定的RSD為1.4%～5.0%，可用于黃瓜樣品中膠霉毒素殘留量的檢測(cè)。