楊勤，楊德全，龔偉（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心，重慶404120）

狼毒大戟是大戟科狼毒屬植物的干燥根，性味辛、平，有大毒[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其具有“主咳逆上氣，破積聚，飲食，寒熱，水氣，惡瘡，鼠瘺疽蝕，蠱毒”等功效。臨床上已有大量報道證明狼毒大戟對肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤有獨特療效，但其抗癌機制尚未明確[2-4]。本研究通過檢測狼毒大戟對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等方面的影響，探討狼毒大戟抑制肝癌細胞上皮間質(zhì)化（EMT）的機制，為進一步研發(fā)該藥提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞MHCC97H購于北納創(chuàng)聯(lián)。

1.1.2 藥物 狼毒大戟采自云南香格里拉，經(jīng)大理大學(xué)張德全副教授鑒定為大戟科狼毒大戟的干燥根。

1.1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）購于Hyclone公司。胎牛血清購于Lonsera公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），Transwell小室、Matrigel膠購于 Corning公司?？谷薊-cadherin單抗（ab40772）和抗人Vimentin單抗（ab92547）購于 Abcam公司。β-actin購于 Genetex公司。辣根過氧化物酶標記抗兔免疫球蛋白G（IgG）購于中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞MHCC97H采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.2.2 狼毒大戟活性部位的提取分離 取干燥狼毒大戟生品200 g，粉碎，過60目篩，用95%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，得狼毒生品的總提取物。用少量水將浸膏分散，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取多次至各有機相無色，合并萃取液，揮干溶劑得各極性部位石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸膏。分別稱取狼毒大戟提取物1 g，加入DMSO使其完全溶解（體積分數(shù)小于0.1%），定容至刻度，制成供試品母液，在超凈臺內(nèi)無菌過濾，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成所需質(zhì)量水平。

1.2.3 MTT法檢測狼毒大戟不同提取部位對MHCC97H增殖的影響 試驗分為對照組、不同提取部位給藥組。對照組是接種細胞但不加入藥物，不同提取部位給藥組是在各個提取部位不同水平梯度的含藥培養(yǎng)液中孵育細胞。取狼毒大戟乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等4個提取部位的母液，用培養(yǎng)液配制成以下水平梯度：31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL。取對數(shù)生長期的細胞，制成5×105mL?1的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，換成含有上述不同水平藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO震蕩10 min，通過酶標儀在490 nm處檢測各孔的吸光度值（A），計算細胞抑制率。

1.2.4 細胞劃痕試驗 為排除藥物細胞毒作用對細胞EMT的影響，后續(xù)試驗選用乙酸乙酯部位和正丁醇部位的 3 個水平值（125、250、500 μg/mL）作用 24 h后作深入研究，將其作為乙酸乙酯組和正丁醇組。取24孔板，用標記物筆在板底均勻劃橫線作為標記，每孔加5×105mL?1細胞，細胞貼壁后，用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去掉落的細胞，加入乙酸乙酯組和正丁醇組的稀釋液（終水平為125、250、500 μg/mL），用含 1%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)，24 h 后鏡下拍照，每組取5個視野拍照，測定各劃痕在0、24 h的寬度，計算細胞遷移的距離，用愈合率代表愈合能力。

1.2.5 細胞遷移試驗 取對數(shù)生長期MHCC97H肝癌細胞，用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞懸液水平為 1×106mL?1，在 Tranwell小室上室中加入乙酸乙酯組和正丁醇組不同水平稀釋液的細胞懸液0.1 mL，下室加入0.6 mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組種3個復(fù)孔，將Transwell小室的24孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，用棉簽去除上室中殘留細胞，置于200×顯微鏡下，隨機選取5個視野，計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)。

1.2.6 細胞侵襲試驗 將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，Matrigel膠稀釋液均勻鋪在Transwell小室底部，每孔100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)成膠后取出，細胞接種和藥物添加同1.2.5項，培養(yǎng)24 h后，棄去上室液體，用4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽去除上室中殘留細胞，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，置于200×顯微鏡下，隨機選取5個視野，計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)，計算平均值。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測E-cadherin和Vimentin蛋白表達 不同水平的狼毒大戟乙酸乙酯組和正丁醇組處理MHCC97H肝癌細胞24 h，常規(guī)消化細胞后用冰PBS洗滌2次，加入裂解液裂解細胞，離心提取細胞總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白水平，并根據(jù)蛋白提取物水平確定上樣量。取蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），轉(zhuǎn)膜后，NC膜用封閉液封閉1 h，分別加入一抗 E-cadherin（1∶1 500）、Vimentin（1∶2 500），4 ℃過夜。TBST 洗滌 4次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育 1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光，經(jīng)凝膠成像儀顯影，測定灰度值。以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H肝癌細胞的增殖抑制作用 分別處理24、48、72 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組水平在 31.25～1 000.00 μg/mL時對 MHCC97H細胞的抑制作用呈時間和劑量依賴性，且乙酸乙酯組對細胞的抑制率明顯高于正丁醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1。石油醚部位與氯仿部位對MHCC97H無明顯抑制作用。

2.2 狼毒大戟提取部位對MHCC97H細胞劃痕愈合率的影響 劃痕24 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組MHCC97H細胞的遷移距離小于對照組，遷移能力受到明顯抑制。正丁醇組在125 μg/mL時愈合率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；乙酸乙酯組和正丁醇組各水平的愈合率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。乙酸乙酯組各水平愈合率與正丁醇組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 MTT法檢測狼毒大戟提取部位對MHCC97H肝癌細胞增殖能力的影響

圖2 狼毒大戟提取部位對MHCC97H細胞劃痕愈合率的影響

2.3 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H肝癌細胞遷移和侵襲的影響 細胞遷移試驗顯示，培養(yǎng)24 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組穿過小室濾膜的遷移細胞數(shù)明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；乙酸乙酯組和正丁醇組各水平遷移細胞數(shù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。細胞侵襲試驗顯示，隨著乙酸乙酯和正丁醇水平的增加，穿過基質(zhì)膠到達小室底端的細胞數(shù)量逐漸減少，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。見圖3、4。

圖3 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H細胞遷移的影響

圖4 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H細胞侵襲的影響

2.4 狼毒大戟提取部位對MHCC97H肝癌細胞中E-cadherin和Vimentin表達的影響 在狼毒大戟提取部位干預(yù)后，MHCC97H肝癌細胞中，乙酸乙酯組和正丁醇組的Vimentin蛋白表達水平均明顯下調(diào)，而E-cadherin的蛋白表達水平均逐漸上調(diào)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 5、6。

圖5 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H細胞E-cadherin蛋白相對表達的影響

圖6 狼毒大戟各提取部位對MHCC97H細胞Vimentin蛋白相對表達的影響

3 討 論

肝癌轉(zhuǎn)移是嚴重影響預(yù)后的重要因素[5]。EMT是上皮細胞失去極性，經(jīng)過細胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型的過程。EMT與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，是近年來抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一[6-8]。其中E-cadherin是EMT的特異性標志物之一，其表達水平降低可導(dǎo)致腫瘤細胞間黏附能力減低，遷移能力增強，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。Vimentin是間質(zhì)細胞的重要標志物之一，抑制Vimentin的表達可以減弱腫瘤細胞遷移能力[10]。

中醫(yī)認為，肝癌的病理特點在于肝失疏泄，導(dǎo)致氣滯血瘀，氣郁化火，日久可成熱毒，熱毒內(nèi)蘊，漸成癥瘕，故“以毒攻毒”是中醫(yī)治療癌癥的重要方法。臨床應(yīng)用有毒中藥治療腫瘤已經(jīng)取得較好的療效，從中挖掘提取有效的抗腫瘤藥物已成為當前研究的趨勢[11-12]。狼毒大戟作為一種有毒的中藥，主要含萜類、苯乙酮類、鞣質(zhì)類、甾醇、揮發(fā)油等成分[13]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其有效成分具有抗腫瘤活性[14]。簡白羽等[15]報道，狼毒大戟中的沒食子酸乙酯體外試驗?zāi)芤种迫私Y(jié)腸癌LOVO細胞、肺癌A549細胞、口腔鱗癌CAL-27細胞的增殖。楊柯等[16]試驗表明，狼毒大戟提取液能明顯促進人肺癌細胞的凋亡，將細胞周期阻滯在S期，并能明顯促進Bax mRNA，抑制Bcl-2mRNA的表達。姜紅[17]報道，腹腔注射狼毒大戟提取液，連續(xù)7 d，能明顯抑制小鼠Lewis肺癌生長，發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制增殖細胞抗原（PCNA），進而抑制腫瘤細胞的增殖。目前的研究主要圍繞狼毒大戟對多種腫瘤細胞增殖的抑制作用，但對肝癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用及機制研究較少。

本研究選擇了高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株MHCC97H細胞來檢測狼毒大戟對腫瘤細胞遷移、侵襲能力的影響。MTT結(jié)果表明，乙酸乙酯和正丁醇部位對肝癌細胞的增殖有抑制作用，且乙酸乙酯提取部位的抑制作用明顯強于正丁醇提取部位，證明乙酸乙酯提取部位有明顯的抗腫瘤活性。劃痕試驗和Transwell小室試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，乙酸乙酯組和正丁醇組干預(yù)后，肝癌細胞的遷移和侵襲能力明顯降低，同時檢測到標志性蛋白分子E-cadherin表達上調(diào)，Vimentin表達下調(diào)，提示兩者的干預(yù)能夠抑制肝癌細胞MHCC97H細胞發(fā)生EMT。

綜上所述，狼毒大戟乙酸乙酯和正丁醇提取部位能夠抑制肝癌細胞發(fā)生EMT，從而降低肝癌侵襲及遠處轉(zhuǎn)移的概率，發(fā)揮其抗腫瘤的藥性。乙酸乙酯提取部位是狼毒大戟治療肝癌的重要生物活性成分，值得進一步研究。