張成晨，劉莉娟，李楠，郭秀麗，章夢琦，肖娟，翟立紅△，龔文容（.湖北文理學院，湖北襄陽44053；.襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北440）

結腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，全球各個地區(qū)的發(fā)病率存在明顯差異，但發(fā)病率和病死率排名均靠前。其在西歐、北美等發(fā)達國家中的發(fā)病率高于亞洲、非洲。近些年，我國結腸癌發(fā)病率已超過發(fā)達國家，這與人們的高脂肪飲食習慣有關[1]。結腸癌在發(fā)生和演變過程中受不同基因誘導調控，ARGONAUTE蛋白和DICER酶是RNA誘導沉默復合體（RISC）的主要組分，在RNA干擾中發(fā)揮重要作用。人類ARGONAUTE家族分成AGO亞家族和PIWIL亞家族，共有八大成員，分別為 AGO1、AGO2、AGO3、AGO4、PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4基因。人類DICER家族有2位成員分別為DICER和DROSHA蛋白。近年來，相關研究表明，ARGONAUTE家族和DICER家族在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均有密切聯系，可作為診斷腫瘤的新指標。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測分析AGO和DICER基因家族在正常結腸組織和癌組織中的表達情況，探討其與結腸癌的關系，初步探索ARGONAUTE和DICER基因家族在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其在臨床中的意義?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究選取襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科術中結腸癌切除后即取配對的癌組織和癌旁組織，并經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 RNA提取試劑盒（艾德萊），逆轉錄試劑盒（TOYOBO），SYBR green qPCR mix（艾德萊），熒光定量PCR儀（ABI）。

1.3 方法

1.3.1 結腸癌組織和癌旁組織的cDNA獲取 將取得的結腸癌組織和癌旁組織標本置于凍存管中，立即投入液氮中速凍，在液氮中保存。提取RNA時取約0.2 g凍存組織，按RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，依據逆轉錄試劑盒說明書，將提取的RNA逆轉錄成 cDNA。RNA 熱變性：12 μL 體系，RNase Free H2O 8 μL，Oligo（dt）20 μL，Total RNA 3 μL。PCR 條 件 ：65℃、5 min，立即置于冰上；隨后在離心機離心：3 500 r/min、1 s。逆轉錄反應：20 μL 體系，第一步 RNA 變性溶液 12 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，ReverTra Ace 1 μL。PCR 條件：95 ℃、3 min，42 ℃、20 min，99 ℃、5 min，4 ℃、5 min。隨后在離心機離心：3 500 r/min、1 s。依據表1合成的引物檢測，cDNA轉錄成功。

表1 qPCR所用引物序列

1.3.2 ARGONAUTE和DICER基因家族的引物合成 在NCBI上搜索目的基因，找到目的基因的mRNA，選擇合適的編碼序列。用Primer Premier 5軟件將引物序列設計好并發(fā)送至上海生工生物工程技術服務有限公司合成。所用引物序列見表1。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測ago和DICER家族表達 應用96孔PCR板，qPCR反應體系共25 μL，溶解曲線條件為 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃，15 s。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環(huán)。根據公式 ΔΔCt=（結腸癌 CtAGO家族?結腸癌CtGAPDH/β-actin）?（癌旁組織 CtAGO家族?癌旁組織 CtGAPDH/β-actin），每個標本重復試驗3次，結果取平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析。采用Mann-WhitneyU檢驗AGO和DICER家族在癌癥組織和癌旁組織中表達的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結 果

結腸癌及癌旁組織中AGO亞家族表達的實時熒光定量PCR結果，見圖1。AGO2在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AGO1、AGO3、AGO4在結腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結腸癌及癌旁組織中PIWIL亞家族表達的實時熒光定量PCR結果，見圖2。PIWIL亞家族成員在結腸癌中的表達明顯低于癌旁組織，其中2種組織PIWIL1、PIWIL2表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結腸癌及癌旁組織中DICER家族表達的實時熒光定量PCR結果見圖3。DICER家族成員在結腸癌中的表達低于癌旁組織，DICER、DROSHA表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 2種組織中ARGONAUTE亞家族表達

圖2 2種組織中PIWI亞家族表達

圖3 2種組織中DICER家族表達

3 討 論

ARGONAUTE蛋白家族是一類高度保守的堿性蛋白，共同結構有PAZ結構域、MID結構域和PIWI結構域[2]。PAZ結構域和PIWI結構域形成特殊分子結構，建立了一個供底物結合的溝槽，有助于siRNA和目標mRNA結合，并可以剪切 mRNA[3]。AGO2蛋白結合DICER酶等組成了RISC，DICER酶剪切dsRNA形成的siRNA并入RISC，隨后高度特異性地結合并降解靶標基因mRNA。RISC在siRNAs或miRNAs引導的基因沉默過程中，通過AGO蛋白催化活性直接啟動靶mRNAs的降解[4]，這一過程是在RNAi中發(fā)揮重要作用的關鍵步驟。AGO2被發(fā)現在膀胱上皮癌[5]、頭頸部鱗狀細胞癌[6]、卵巢上皮癌中過度表達[7]。AGO2的過度表達已被證實與腫瘤細胞的生長、患者的總體生存率有關[8-9]。然而，也有報道稱，在黑素瘤中，AGO2的表達明顯降低[10]，通過基因操作過度表達AGO2則可以抑制細胞和腫瘤的生長[11-12]。AGO2在不同組織的不一致表達水平可以解釋為：由于不同的miRNAs表達模式，AGO2的表達水平會因癌癥類型不同而不同[13-14]。此外，AGO2還被發(fā)現與癌癥血管生成、轉移等有關。這些過程的調控機制也會因癌癥的類型和階段不同而不同。癌癥類型、癌癥分期、miRNAs的表達模式和腫瘤發(fā)育調節(jié)機制是AGO2表達和功能的主要影響因素。有研究表明，AGO2直接與某些惡性腫瘤的已知腫瘤因素相互作用，而miRNA卻不參與此過程。SHANE等[15]報道AKT3可以使在S387上的AGO2磷酸化，抑制AGO2與GW180結合進入P小體，從而抑制靶基因的表達。本試驗AGO2的表達和其他研究結果一致，結腸癌中AGO2的過度表達，可能與miRNA參與或結腸癌的癌癥因素作用有關，其上調表達背后的機制還需進一步研究闡明。

AGO1在人體組織中普遍表達，尤以皮膚中明顯表達。VERA等[16]從核層次證實核AGO1調節(jié)了AGO1結合基因的表達，這些基因參與了包括細胞周期進展、生長和存活在內的致癌途徑。研究發(fā)現，在黑素瘤細胞系中Mel Ei和Mel Ho細胞表現出最高的AGO1表達水平；在上皮結腸直腸癌細胞表現出AGO2的高表達和AGO1的低表達；在肝癌HepG2細胞表現出AGO1 mRNA高表達[17]。AGO3和AGO4在人體組織中都呈弱陽性表達，但AGO3、AGO4在某些惡性腫瘤中常發(fā)生缺失，暗示惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與AGO3和AGO4蛋白的低水平表達或沉默有關。本研究試驗結果顯示，AGO1、AGO3、AGO4均明顯表達下調，可能與所在染色體的丟失或siRNA對AGO蛋白的沉默有關。

PIWIL亞家族蛋白質主要在生殖細胞中表達，其功能是維持生殖干細胞和減數分裂，以及干細胞自我更新。腫瘤干細胞的形成是腫瘤發(fā)生的起始。PIWIL亞家族也與惡性腫瘤有關。在乳腺癌[18-19]、胃癌[20]、食管癌和子宮內膜癌中都檢測到PIWIL1的表達上調[21-22]。范正軍等[23]研究表明，PIWIL1在肝癌組織中高表達暗示患者預后不良。同樣，研究表明，在軟組織肉瘤和胰腺導管腺癌中，PIWIL1高表達提示患者的預后不良[24-25]，暗示這種關系也可能會出現在其他惡性腫瘤中。研究發(fā)現，PIWIL1在不同肝癌細胞系中上調或下調，其中的機制需要進一步研究[26]。PIWIL2在人體睪丸、卵巢、小腸、十二指腸組織中陽性表達，特別是在睪丸中明顯陽性表達。有研究發(fā)現，PIWIL2表達上調會導致精原細胞瘤發(fā)生。在早期宮頸癌和乳腺癌中[27-28]，PIWIL2表達上調且廣泛，可以作為診斷腫瘤的標志物。研究發(fā)現，在非小細胞肺癌（NSCLC）中PIWIL1和PIWIL2高表達，并且PIWIL1和PIWIL2表達與腫瘤增殖呈正相關[29-30]。PIWIL2在預后差的NSCLC中表達過量，因此，PIWIL2可以作為判斷NSCLC預后情況的1項指標。PIWIL3蛋白在人體睪丸中陽性表達，在其他組織中不表達，近期被發(fā)現在人星形細胞神經膠質瘤和腦脊膜瘤細胞質中表達。PIWIL4在人體組織中廣泛表達，其中以睪丸和骨髓組織中陽性表達明顯，但也在轉移性肺癌、胃癌等癌細胞中表達。研究發(fā)現，PIWIL4在乳腺癌中高表達，降低表達會影響癌細胞的遷移能力[31]。PIWIL亞族成員在本研究癌組織中均是表達下調。PIWIL1和PIWIL2在不同的癌組織中上調或下調，表明可能有未知的通道或miRNA影響PIWIL蛋白的表達。

miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而miRNA由DICER和Drosha酶剪接生成，因此，DICER和Drosha的異常表達也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。本研究中DICER和Drosha的表達下調，這與已知研究結果一致。曹政[32]研究發(fā)現，DICER和Drosha蛋白在骨肉瘤中表達呈高陽性表達，而在骨軟骨瘤中呈低陽性表達，且兩者在骨肉瘤和骨軟骨瘤中呈明顯正相關，提示其可能共用同一途徑發(fā)揮作用。現有文獻表明，DICER和Drosha在人子宮內膜癌、鼻咽癌、乳腺癌、神經母細胞瘤等大多數腫瘤中表達下調[33-36]。有研究對 Be2C、NMB7、NB5等3種神經母細胞瘤細胞系進行操作，沉默DICER或Drosha基因后顯示miR-17-5p和let-7a低表達，瘤細胞的增殖能力明顯增強[36]。研究表明，對肺癌、卵巢癌、結直腸癌患者而言，DICER和Drosha表達下調意味著其預后不良[37-39]。

本研究中，人類ARGONAUTE和DICER基因家族在結腸癌中均為異常表達，呈明顯上調或下調。在結腸癌中只有AGO2明顯上調。雖然AGO2的功能復雜，其在結腸癌的作用機制尚不十分清楚，但這為以后結腸癌的治療研究提供了方向，希望其可成為治療結腸癌的新分子靶點。其他AGO蛋白均為表達下調，多數只在特別的癌組織中被激活通道表達，但其參與結腸癌的過程還不清楚。DICER和Drosha在結腸癌中表達下調，表明患者預后不良，可以作為患者預后的一個新標志物。今后，還需要進一步研究其與特定miRNA的作用關系，為治療結腸癌提供新的分子靶點。