沈 鑫，陳艷敏，李永紅，蔣冬月*

(1.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023；2.深圳職業(yè)技術(shù)學院，廣東 深圳 518055)

花葉艷山姜(Alpiniazerumbetcv.Variegata)是姜科(Zingiberaceae)山姜屬(Alpinia)艷山姜(Alpiniazerumbet)的栽培品種，為多年生常綠草本觀葉植物。葉色艷麗，有金黃色的縱斑紋、斑塊，富有光澤，十分迷人；花冠白色，邊緣黃色，花瓣頂端紅色，花姿優(yōu)美，花香清純，花期夏季，是觀賞價值很高的觀葉觀花植物，在我國南方各省均有栽植[1-2]?；ㄈ~艷山姜不僅形態(tài)優(yōu)美，而且香味獨特，更重要的是其精油具有抗氧化、抗炎抑菌、鎮(zhèn)痛以及防治心血管系統(tǒng)疾患等多方面的功效，在民間是祛寒暖胃、治療消化不良和嘔吐腹瀉等疾病的良藥[3-6]。目前對花葉艷山姜的研究主要集中在生理特性[7-8]、無性繁殖[9-10]、精油化學成分及提取技術(shù)[11,16]等方面，并未見有關花葉艷山姜花瓣揮發(fā)性有機物成分及葉片揮發(fā)性有機物成分變化規(guī)律的相關報道?，F(xiàn)有其他物種的研究表明，隨著環(huán)境、氣候等條件的改變，植物釋放的揮發(fā)性有機物的成分及相對含量也會隨之變化[17,23]。因此，本研究采用固相微萃取技術(shù)吸附采集不同時期花葉艷山姜葉片揮發(fā)性有機成分，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測并分析花葉艷山姜不同季節(jié)及一天中不同時間釋放的揮發(fā)性有機物成分及相對含量，揭示其葉片揮發(fā)性有機物的季節(jié)變化規(guī)律和日變化規(guī)律；并用相同的方法研究花葉艷山姜葉片和花瓣揮發(fā)性有機物成分的差異，為科學利用花葉艷山姜營造生態(tài)型、保健型、芳香園林景觀提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用花葉艷山姜苗齡5 a，苗高90～130 cm，葉長45～55 cm，葉寬15～20 cm，長勢繁茂，無病蟲害，種植于深圳職業(yè)技術(shù)學院西校區(qū)芳香植物園內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物揮發(fā)性有機物的采集和測定 分別于3月、6月、9月、12月的15日09:00—10:00在同一位置的植物上摘取向陽側(cè)上、中、下部位的健康無損傷的葉片10片，分別剪碎混勻，稱取0.5 g放置5 mL萃取瓶中密封，靜置30 min，環(huán)境溫度為(22±3)℃。將型號為DVB-CAR-PDMS 100 μm的SPME纖維頭(美國Supelco公司)通過聚四氟乙烯瓶墊插入到萃取瓶中，置于樣品正上方0.5 cm左右，頂空萃取40 min，然后將纖維頭插入6890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)的GC進樣口，解吸10 min。每次收集設置三次重復，吸附空萃取瓶中的氣體作為空白對照?；ò険]發(fā)性有機物的測定于6月16日進行，09:00—10:00采摘盛開的花朵5朵；揮發(fā)性有機物日動態(tài)變化的測定于6月16日進行，08:00—20:00每2 h采樣1次。

色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱色譜柱，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚0.25 μm，載氣為高純氦氣，不分流進樣，恒流流速1.0 mL/min，進樣口溫度230 ℃，接口溫度280 ℃。季節(jié)變化和花瓣揮發(fā)物測定選擇初始溫度50 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min升至250 ℃，保持8 min。日動態(tài)變化規(guī)律測定選擇初始溫度50 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子阱溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 揮發(fā)性有機物成分經(jīng)氣相色譜分離，各色譜峰、質(zhì)譜峰分別利用GC-MS中MSD Productivity ChemStation和NIST Mass Spectral Database 2008譜庫進行分析鑒定。各成分在樣品氣體中的濃度采用峰面積歸一法進行計算，計算公式為：濃度=(該物質(zhì)峰面積/樣品所有氣體峰面積之和)×100%，通過該公式計算得出的結(jié)果代表某物質(zhì)在所采集的總氣體樣品中的相對百分含量。

2 結(jié) 果

2.1 花葉艷山姜葉片揮發(fā)性有機成分和含量的季節(jié)動態(tài)變化

通過GC/MS分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，從花葉艷山姜葉片一年中不同季節(jié)釋放的揮發(fā)性有機物中共鑒定出26種化合物(圖1，表1)。其中萜烯類化合物12種，醇類化合物8種，以及少量的酯類、酮類、酸類和其他化合物，主要成分為(1R)-(+)-α-蒎烯、莰烯、α-石竹烯、桉樹醇和鄰異丙基甲苯等。從3月到12月，檢測到葉片釋放的揮發(fā)性有機物種類數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在6月份達到最多，為22種，3月份檢測到的種類最少，僅為6月份的二分之一(圖2)。3月份檢測到的揮發(fā)性有機物的種類以萜烯類為主，但醇類物質(zhì)的相對含量較萜烯類高。其中桉樹醇的相對含量最高，為74.58%，其次為鄰異丙基甲苯、莰烯、右旋樟腦和(1R)-(+)-α-蒎烯，其相對含量分別為6.65%、4.83%、4.54%和4.03%。6月份檢測到的揮發(fā)性有機物成分主要是萜烯類和醇類化合物，較3月份分別增加4種和5種，并檢測到了酸類物質(zhì)。各組分的相對含量仍以桉樹醇為最高，其次為鄰異丙基甲苯、(1R)-(+)-α-蒎烯和莰烯。9月和12月份檢測到的揮發(fā)性有機物種類較6月份有所減少，主要表現(xiàn)在萜烯類和醇類物質(zhì)的數(shù)量上。

表1 花葉艷山姜葉片釋放的揮發(fā)性有機物成分及相對含量的季節(jié)變化

“-”：未檢測到或不存在

“-”:Not detected or not existed

圖1 花葉艷山姜葉片不同季節(jié)釋放揮發(fā)性有機物的總離子流圖Fig.1 The TIC of VOCs released from leaves of A.zerumbet cv.Variegata in different seasons

由圖2可以看出，一年中不同季節(jié)，花葉艷山姜葉片釋放的酯類物質(zhì)的相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在9月份含量最高，3月份含量最低，僅為9月份的六分之一；萜烯類物質(zhì)含量的變化趨勢同酯類相同，但在6月份其相對含量達到最高，為25.93%；酮類物質(zhì)總體呈下降趨勢，且在12月份并未檢測到該類化合物；醇類化合物的相對含量從3月到9月呈下降趨勢，9月份最低，12月份其含量有所回升；其他物質(zhì)中的含苯化合物的相對含量則呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢。其主要成分的變化趨勢如下：桉樹醇的相對含量呈現(xiàn)高-低-高的趨勢，α-石竹烯、β-月桂烯和鄰異丙基甲苯則呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢，(1R)-(+)-α-蒎烯和莰烯的相對含量呈現(xiàn)低-高-低-高的變化趨勢。

圖2 一年中不同季節(jié)花葉艷山姜葉片釋放的各類揮發(fā)物數(shù)量和相對含量的變化Fig.2 The component numbers and relative contents of classified VOCs from leaves in different seasons of a year

英文名稱English name中文名Chinese name相對含量/% Relative content8:0010:0012:0014:0016:0018:0020:002-Propenoic acid,3-phenyl-,methyl ester肉桂酸甲酯1.151.480.961.001.320.941.621R-.α.-Pinene(1R)-(+)-α-蒎烯8.909.7210.1111.8510.8311.2810.43Bicyclo[2.2.1]heptane,2,2-dimethyl-3-methylene-,(1S)-(-)-莰烯4.836.545.53-6.28--.β.-Phellandreneβ -水芹烯2.33------.β.-Myrceneβ-月桂烯3.092.883.443.282.613.021.68Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene,3,7,7-trimethyl-δ-2-蒈烯0.280.30-0.330.290.310.251,3-Cyclohexadiene,1-methyl-4-(1-methylethyl)-α-萜品烯0.16-0.13----1,4-Cyclohexadiene,1-methyl-4-(1-methylethyl)-γ-萜品烯0.430.330.930.890.680.840.27Caryophyllene石竹烯0.950.540.670.570.650.560.25.α.-Caryophylleneα-石竹烯3.101.531.991.752.151.800.49Naphthalene,1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydr o-7-methyl -4-methylene-1-(1-methylethyl)-,(1.α.,4a.β.,8a.α.)-(-)-g-蓽澄茄烯0.310.350.280.230.320.240.261H-Cyclopropa[a]naphthalene,1a,2,3,3a,4,5,6,7b -oc-tahydro-1,1,3a,7-tetramethyl-,[1aR-(1a.α.,3a.α.,7b.α.)]-未命名0.08------Bicyclo[3.1.1]heptane,6,6-dimethyl-2-methylene-,(1S)-(1S)-(-)-β-蒎烯-2.08-----Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,2-methyl-5-(1-methyleth-yl)-3-檸烯--0.63---0.46Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-檜烯--0.84-2.65--.β.-Pineneβ-蒎烯--1.902.82-2.461.78Cyclohexene,1-methyl-4-(1-methylethylidene)-萜品油烯--0.31----Camphene莰烯---6.68-6.727.46Naphthalene,decahydro-4a-methyl-1-methylene-7- (1-methylethenyl)-,[4aR-(4a.α,7α,8a.β.)]-β-桉葉烯----0.10--3-Carene3-蒈烯------0.28Phenol,4,4'-(1-methylethylidene)bis-聚丁基雙酚-A0.38------Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one,1,7,7-trimethyl-,(1R)-右旋樟腦2.072.381.691.911.812.102.122-Butanone,4-phenyl-4-苯基-2-丁酮-0.23----0.12n-Hexadecanoic acid棕櫚酸5.240.060.070.070.110.060.06Oleic Acid油酸2.05------Octadecanoic acid硬脂酸0.03------12-Oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene,1,5,5,8-tet-ramethyl-,[1R-(1R*,3E,7E,11R*)]-葎草烯環(huán)氧化物0.37----0.28-1,3,5-Triazine-2,4-diamine,6-phenyl-苯并胍胺1.230.070.080.080.160.100.08Benzene,1-methyl-2-(1-methylethyl)-鄰異丙基甲苯13.5717.7815.6415.8213.7215.3117.103,6-Dimethyl-2,3,3a,4,5,7a-hexahydrobenzofuran未命名-0.200.270.25--0.24Eucalyptol桉樹醇46.9350.5851.2250.3654.0951.8053.471,6-Octadien-3-ol,3,7-dimethyl-芳樟醇1.921.471.791.541.771.631.053-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)-4-萜烯醇0.140.170.160.170.140.180.203-Cyclohexene-1-methanol,.α.,.α.4-trimethyl-α-萜品醇0.480.360.420.42-0.39-3-Hexen-1-ol,(Z)-順-3-己烯-1-醇-0.780.78----Benzenepropanol,.β.-methyl-β-甲基-苯丙醇-0.08-----1,6,10-Dodecatrien-3-ol,3,7,11-trimethyl-,(E)-反式-橙花叔醇-0.090.17-0.34--3-Cyclohexene-1-methanol,.α.,.α.,4-trimethyl-,(S)-松油醇、萜品醇------0.35

“-”：未檢測到或不存在

“-”:Not detected or not existed

2.2 花葉艷山姜葉片揮發(fā)性有機物成分和含量的日變化

花葉艷山姜葉片在08:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00時釋放的揮發(fā)性有機物，通過GC/MS分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，共鑒定出38種化合物(表2)。其中萜烯類化合物19種、醇類化合物8種、酸類化合物3種，以及少量的酮類、酯類、烷類和其他類化合物，主要成分為(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、鄰異丙基甲苯、桉樹醇等。一天中不同時段葉片釋放的揮發(fā)性有機物種類存在差異(圖3)，從08:00到12:00葉片釋放的揮發(fā)性有機物種類維持在24種，12:00之后種類逐漸下降到19種，20:00時種類數(shù)又增加到22種。08:00到12:00檢測出的揮發(fā)性有機物種類以萜烯類最多，其次是醇類化合物，但醇類物質(zhì)的相對含量高于萜烯類化合物的含量。其中桉樹醇、鄰異丙基甲苯、(1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-莰烯的相對含量較高。14:00到18:00檢測出的揮發(fā)物種類較12:00時減少，主要表現(xiàn)在萜烯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)數(shù)量的減少。20:00時檢測到的揮發(fā)物種類較18:00時增加，但仍然低于12:00前的數(shù)量，其中酯類物質(zhì)的相對含量達到一天中最高。一天中，每個時間段都檢測到的化合物有肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、α-石竹烯、γ-萜品烯、石竹烯、(-)-g-蓽澄茄烯、右旋樟腦、棕櫚酸、苯并胍胺、鄰異丙基甲苯、桉樹醇、芳樟醇和4-萜烯醇。

從圖3可以看出，一天中不同時段，花葉艷山姜葉片釋放的酯類物質(zhì)的相對含量變化曲線呈現(xiàn)三峰兩谷，在18:00時相對含量最低，20:00達到最高；萜烯類物質(zhì)的相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其相對含量在14:00時最高，為28.39%；醇類化合物的相對含量在總揮發(fā)物含量中一直保持最高，在小范圍內(nèi)震蕩變化；烷類和酸類化合物在08:00時含量最高，且烷類化合物僅在08:00出現(xiàn)；酮類化合物的相對含量變化較小。其主要成分的變化趨勢如下：(1R)-(+)-α-蒎烯的相對含量呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢，β-月桂烯呈現(xiàn)高-低-高-低的變化趨勢，鄰異丙基甲苯和桉樹醇的相對含量呈現(xiàn)低-高-低-高的變化趨勢。

圖3 1 d中不同時段花葉艷山姜葉片釋放的各類揮發(fā)物數(shù)量和相對含量的變化Fig.3 The component numbers and relative contents of classified VOCs from leaves in different time of a day

2.3 花葉艷山姜花與葉片揮發(fā)性有機成分和含量的對比分析

通過花葉艷山姜葉片與花瓣的SPME/GC/MS總離子流圖分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，在花葉艷山姜葉片和花瓣中一共鑒定出22種揮發(fā)性有機物，其中萜烯類化合物17種，酯類、醇類和酮類化合物各1種(表3)。葉片共檢測出11種揮發(fā)性成分，其中萜烯類化合物最多，為7種，但醇類化合物的相對含量最高，為74.58%。而在花瓣中共檢測出21種揮發(fā)性有機物質(zhì)，其中萜烯類化合物為17種，占花瓣總揮發(fā)物含量的54.37%，其次為醇類物質(zhì)，占21.44%。葉片中檢測到的含量最多的揮發(fā)性成分是桉樹醇，為74.58%，其次為鄰異丙基甲苯和莰烯，其相對含量分別為6.65%和4.83%?；ò曛袡z測到的含量最多的揮發(fā)性成分是(1R)-(+)-α-蒎烯，含量為22.09%，其次是桉樹醇和間異丙基甲苯，其相對含量分別為21.44%、20.83%?；ㄈ~艷山姜葉片與花瓣中都檢測到的揮發(fā)性有機物一共有10種，分別為肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、石竹烯、α-石竹烯、(-)-g-蓽澄茄烯、右旋樟腦和桉樹醇。

表3 花葉艷山姜葉片與花瓣釋放的揮發(fā)性有機物成分及相對含量

“-”：未檢測到或不存在

“-”:Not detected or not existed

3 討 論

大多數(shù)研究者常采用水蒸氣蒸餾法對艷山姜揮發(fā)物進行提取，此方法雖然簡單易行，但非活體提取，長時間高溫提取會使某些揮發(fā)性物質(zhì)受到破壞。而本研究采用固相微萃取采集法，所需樣品量少，無需溶劑，操作簡化，集采樣、萃取、濃集、進樣于一體，非常適合芳香植物揮發(fā)性成分的研究，已在植物的香氣成分分析中得到應用[24-26]。

前人對植物揮發(fā)性有機物釋放規(guī)律的研究表明，揮發(fā)物釋放的種類和相對含量與采樣時溫度、濕度、氣孔導度、光照以及蒸騰速率等關系密切[17-19,21,23]。一年中花葉艷山姜葉片檢測到的揮發(fā)性有機物種類數(shù)量先上升后下降，在6月份達到最多，為22種，3月份檢測到的種類最少，僅為6月份的二分之一。這可能是因為3月份光照時間較短，溫度都較低，此時植物體內(nèi)合成代謝較慢，生長較慢，因此形成的VOCs種類較少；而隨著夏季的到來，光照時間變長，溫度逐漸升高，達到30 ℃左右，植物進入生長旺盛階段，植物自身旺盛的光合作用為有機物合成提供充足的碳源和還原力，體內(nèi)有機物合成、代謝加快，強烈的蒸騰作用也為有機物的擴散創(chuàng)造了條件，其揮發(fā)性有機物的種類增多[27-29]。一天中不同階段，花葉艷山姜葉片釋放的揮發(fā)性有機物種類在12:00達到高峰，這也說明隨著外界環(huán)境條件的改變，植物自身的代謝活動隨之變化，從而影響植物VOCs的合成和釋放。葉片釋放揮發(fā)性有機物種類的多少和相對含量的高低與外界環(huán)境以及植物自身條件的密切相關，這有待后續(xù)進一步深入的研究。植物發(fā)育部位的差異和所處發(fā)育階段的不同對VOCs的釋放也具有十分重要的影響[30-32]。試驗結(jié)果顯示，花葉艷山姜花瓣所含的揮發(fā)性有機物種類要明顯高于葉片；葉片中檢測到的含量最多的揮發(fā)性成分是桉樹醇，為74.58%，而花瓣中檢測到的含量最多的揮發(fā)性成分是(1R)-(+)-α-蒎烯，含量為22.09% 。在葉片和花瓣中共同檢測到的物質(zhì)中，大部分成分在花瓣中的含量要高于葉片。

近年來，隨著科研人員對植物揮發(fā)性有機物研究的深入，植物揮發(fā)性有機物的藥用保健作用日益被人們所重視[33-34]。研究發(fā)現(xiàn)不同植物的氣味對人體產(chǎn)生不同的影響，一部分植物的揮發(fā)性氣味能夠提高人腦α-波的活動，使人情緒趨于放松狀態(tài)，感覺清新、舒爽；例如，檸檬油、雪松醇、龍腦和1,8-桉葉油能夠降低心率和血壓[35]，月季(Rosachinensis)、菊花(Chrysanthemum×morifolium)、雪松(Cedrusdeodara)、側(cè)柏(Platycladusorientalis)、薰衣草(Lavandulaangustifolia)、檀香(Santalumalbum)等植物的氣味可以使人情緒趨向松弛[36-37]。另一部分植物的揮發(fā)性氣味可以提高人腦β-波的活動，使人情緒趨向緊張、焦慮或不快，例如，珍珠梅(Sorbariasorbifolia)[37]、香樟(Cinnamomumcamphora)[38]等植物。本試驗測得花葉艷山姜的主要成分為(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、莰烯、右旋樟腦、桉樹醇等，它們中的部分成分具有藥用、保健功效。如：蒎烯類物質(zhì)可以殺菌抗菌、抗癌、利膽消炎、醫(yī)瘡止癢，并對人體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等有保健作用[39]；β-月桂烯具有降血糖、防癌的功效[40-41]；莰烯具有殺菌、抗菌的作用[42]；右旋樟腦可除濕殺蟲，溫散止痛[43]；桉樹醇具有驅(qū)蟲、調(diào)理腸胃脹氣，止咳化痰，有助入眠的功效[44,45]。這說明花葉艷山姜釋放的揮發(fā)性有機物具有藥用、保健的作用，是營造保健型園林景觀的理想植物。