黃 瑜,丁 博,張德全,譚萬(wàn)森,周 濃,*

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000;2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶 404120)

小根蒜(AlliummacrostemonBunge.)為百合科蔥屬多年生草本植物[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品[2],為《中國(guó)藥典》(2015年版一部)收載品薤白來(lái)源之一,以鱗莖入藥,具有通陽(yáng)散結(jié),行氣導(dǎo)滯之功效[3]?，F(xiàn)代研究表明,小根蒜中含有揮發(fā)油、甾體皂苷、含氮化合物(包括腺苷、胸苷等)、含硫化合物、多糖等化學(xué)成分[4-7],具有抗腫瘤、抗炎、延緩衰老、擴(kuò)張血管、提高機(jī)體免疫力等藥理作用[8-12]。

核苷類成分是細(xì)胞的重要組成部分,作為生物活性成分,其對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等有著很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用,是改善人類健康和預(yù)防疾病的重要組成成分之一[13]。小根蒜(薤白)作為傳統(tǒng)的藥食同源植物,應(yīng)用多以水為溶劑進(jìn)行加工,其水溶性活性成分的生物活性研究已受到一定的關(guān)注,小根蒜具有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷類物質(zhì)[14-16]。因此,小根蒜所含核苷類成分可作為小根蒜質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,核苷類成分已被證實(shí)是重要的生物活性成分,與小根蒜生物活性(抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等)[8-12]具有一定的關(guān)聯(lián)性。目前,針對(duì)小根蒜(薤白)中核苷類含量的檢測(cè)報(bào)道較多[14-16],但對(duì)不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2′-脫氧腺苷8種堿基和核苷的同時(shí)測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。為此,本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地小根蒜中8種堿基和核苷類含量,對(duì)小根蒜的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小根蒜植株 2014年09月至2014年10月,自采或委托采集于重慶市萬(wàn)州區(qū)新鄉(xiāng)鎮(zhèn)等小根蒜種植基地,經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為百合科蔥屬小根蒜Alliummacrostemon的干燥全株(見(jiàn)表1);小根蒜洗凈后,35 ℃下烘箱烘干,粉碎后過(guò)50目篩。尿嘧啶對(duì)照品(批號(hào):100469-200401)、鳥(niǎo)嘌呤對(duì)照品(批號(hào):140631-201205)、尿苷對(duì)照品(批號(hào):110887-200202)、腺嘌呤對(duì)照品(批號(hào):886-200001)、胸苷對(duì)照品(批號(hào):101215-201401)、腺苷對(duì)照品(批號(hào):110879-200202) 由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;鳥(niǎo)苷對(duì)照品、2′-脫氧腺苷對(duì)照品 純度>98%,南京都萊生物技術(shù)有限公司;甲醇色譜純 德國(guó)Merck公司,水 娃哈哈牌純凈水。

表1 樣品來(lái)源

LC-20A型高效液相色譜儀、PDA檢測(cè)器 日本島津集團(tuán);SB-12D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;TDZ4-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司;ML204型分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷對(duì)照品,加純凈水溶解對(duì)照品,并制成質(zhì)量濃度分別為40.00、21.00、330.00、22.00、399.00、118.00、118.00、103.00 μg/mL的對(duì)照品溶液,用0.45 μm混合纖維素微孔濾膜濾過(guò),備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取小根蒜樣品粉末(過(guò)50目篩)0.5 g,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加蒸餾水25 mL,混勻,25 ℃室溫下超聲提取60 min(超聲功率600 W,工作頻率40 kHz),放至室溫,搖勻,倒入離心管中,離心10 min(4000 r·min-1),用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得到供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為A相為甲醇,B相為水,梯度洗脫(0 min→10 min→15 min→20 min→30 min,1% A→5% A→15% A→20% A→30% A);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;體積流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。

1.2.4 檢出限和定量限 將制備好的對(duì)照品溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋后,依次進(jìn)樣10 μL,當(dāng)信噪比等于3時(shí),所對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為最低檢出限;當(dāng)信噪比等于10時(shí),所對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為最低定量限。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)不同產(chǎn)地的14份小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷的含量進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品和供試品色譜分離圖

按照上述色譜條件進(jìn)行分析,各成分分離度良好,混合對(duì)照品和小根蒜樣品(S10)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 核苷混合對(duì)照品(A)及小根蒜樣品(B)的HPLC圖譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 8種對(duì)照品的線性方程、線性范圍、檢出限及定量限

2.3 精密度

取同一混合對(duì)照品溶液10 μL,按1.2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,通過(guò)各對(duì)照品得到的峰面積來(lái)計(jì)算RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差),以此考察儀器的精密度。由表3可知RSD均小于2%,表明該方法精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性

精密稱取同一小根蒜鱗莖樣品6份(S10),每份0.5 g,按1.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液及按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,分別進(jìn)樣10 μL。記錄各核苷峰面積并計(jì)算其RSD,由表4可知RSD均小于3%,表明此方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液(S10)在室溫條件下密閉放置,于0、4、8、12、16、20 h進(jìn)行分別測(cè)定尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷,記錄各核苷峰面積并計(jì)算其RSD,由表5可知RSD均小于3%,表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的小根蒜鱗莖粉末約0.25 g(S10),共6份,分別精密依次加入1.2.1項(xiàng)下各核苷對(duì)照品貯備溶液適量,按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在1.2.3項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣,計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD,在驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明,小根蒜(S10)中8種堿基和核苷的平均回收率在97.72%～100.29%,RSD為1.44%～2.97%,符合分析要求。表明該方法的準(zhǔn)確度較高,能應(yīng)用于小根蒜中8種堿基和核苷的檢測(cè)與分析。

表6 小根蒜中8種堿基和核苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定

不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷的含量結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明:不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中核苷類成分較類似,均含有尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷,不同產(chǎn)地小根蒜中8種堿基和核苷類成分的含量均存在較大的差異,但各核苷類成分無(wú)論是含量還是各成分的比例并沒(méi)有明顯的規(guī)律,這與潘興嬌等[17]對(duì)云南重樓中核苷類成分的研究結(jié)果相一致。以核苷總量為評(píng)價(jià)指標(biāo),重慶市大足縣(S3)、江西省撫州市(S8)、湖南省懷化市(S9)、安徽省績(jī)溪縣(S11)含量較高,與劉紅等[14-15]的報(bào)道結(jié)果相一致,是否與生態(tài)環(huán)境、種質(zhì)資源、田間管理等有關(guān)[15-16],有待進(jìn)一步深入研究。因此,進(jìn)行小根蒜規(guī)?；耘鄷r(shí),栽培基地的選擇對(duì)小根蒜的品質(zhì)形成具有重大影響,本研究結(jié)果將對(duì)小根蒜的栽培基地選擇具有一定的參考意義。同時(shí),尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷為其核苷類物質(zhì)的主要成分,其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他核苷類物質(zhì),胸苷和2′-脫氧腺苷含量次之,尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤含量最少,這與小根蒜[13]、薤(藠頭)[15]的水溶性成分的研究結(jié)果一致。

表7 不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中8種成分的含量(μg·g-1,n=3)

由表7還可知,須根、莖、葉中8種堿基和核苷平均總含量超過(guò)鱗莖,同一產(chǎn)地不同部位的8種堿基和核苷總量部分超過(guò)傳統(tǒng)入藥部位(食用部位),特別是莖、葉生物量較大,提示這些部位均可作為核苷提取物的制備原料。但《中國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定薤白采收時(shí)除去須根,從核苷類成分的相對(duì)含量來(lái)看是否合理,值得進(jìn)一步商榷[3]。

2.8 聚類分析

分別取14批小根蒜鱗莖的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。以表8中小根蒜鱗莖中尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷及總含量為依據(jù),通過(guò)SPSS23.0版本軟件歐式距離平方(squared Euclidean distance)計(jì)算樣品間的相似系數(shù),并用離差平方和法(Ward法)進(jìn)行系統(tǒng)聚類,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 HPLC法同時(shí)測(cè)定小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷類成分含量的聚類分析樹(shù)狀圖

由圖2可知,當(dāng)分類距離為22時(shí),可將14批小根蒜鱗莖分為2類:第一類有11批樣品,即S1、S3-S5、S8-S14,此枝干樣品中8種堿基和核苷總含量均數(shù)均高于小根蒜鱗莖中的平均值;第二類有3批樣品,即S2、S6、S7,此枝干樣品中8種堿基和核苷成分總含量均數(shù)遠(yuǎn)低于平均值。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同產(chǎn)地小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷類成分含量聚類分析的不同組別各組分的平均含量(μg/g)

2.9 核苷的主成分分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)不同產(chǎn)地小根蒜8種堿基和核苷成分含量進(jìn)行主成分分析。結(jié)果見(jiàn)表9，本文采取特征根大于1為提取標(biāo)準(zhǔn),因此得到2個(gè)主成分,且兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為78.73%。第3個(gè)主成分特征根雖然小于1,但前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到89.63%,因此根據(jù)主成分的選取原則,可以選取前3個(gè)主成分代替原始指標(biāo)進(jìn)行分析。其中,第1主成分特征根λ=4.195,方差貢獻(xiàn)率為52.44%,貢獻(xiàn)率最大,包含的信息量大。第2主成分λ=2.103,方差貢獻(xiàn)率為26.29%。第3主成分λ=0.872,方差貢獻(xiàn)率為10.90%。3個(gè)主成分載荷圖見(jiàn)圖3。

表9 不同產(chǎn)地小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷綜合評(píng)價(jià)

圖3 不同產(chǎn)地小根蒜鱗莖中主成分載荷圖

將SPSS 23.0軟件給出的因子負(fù)荷除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征根的平方根,便得到3個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù),表達(dá)式如下:C1=0.334X尿嘧啶+0.380X鳥(niǎo)嘌呤+0.261X尿苷+0.425X腺嘌呤+0.193X鳥(niǎo)苷+0.453X胸苷+0.199X腺苷+0.461X 2′-脫氧腺苷;C2=-0.340X尿嘧啶-0.086X鳥(niǎo)嘌呤+0.323X尿苷-0.160X腺嘌呤+0.604X鳥(niǎo)苷-0.082X胸苷+0.594X腺苷-0.148X 2′-脫氧腺苷;C3=0.352X尿嘧啶-0.484X鳥(niǎo)嘌呤-0.669X尿苷+0.154X腺嘌呤+0.267X鳥(niǎo)苷+0.122X胸苷+0.289X腺苷+0.025X 2′-脫氧腺苷。第1主成分C1與8個(gè)堿基和核苷類成分都呈正相關(guān),其中與胸苷、2′-脫氧腺苷的正相關(guān)性較強(qiáng)。且3個(gè)主成分中,第1主成分貢獻(xiàn)率最大,說(shuō)明胸苷、2′-脫氧腺苷2個(gè)成分在小根蒜鱗莖中核苷類的質(zhì)量控制方面起著重要作用。

將小根蒜鱗莖每種核苷類測(cè)的含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,再將標(biāo)準(zhǔn)化后的值放入到3個(gè)主成分(C1、C2、C3)方程中計(jì)算,得到樣品主成分得分。然后構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)函數(shù)(F):Fj=ω1C1+ω2C2+ω3C3。式中C1、C2、C3為前三個(gè)主成分得分;ω1、ω2、ω3分別為前三個(gè)主成分信息貢獻(xiàn)率。綜合得分見(jiàn)表9。

由表9可知,來(lái)自相同省區(qū)的不同產(chǎn)地小根蒜(鱗莖)中8種堿基和核苷的綜合評(píng)價(jià)也有顯著差異,如重慶市萬(wàn)州區(qū)(S1)綜合評(píng)價(jià)排名第1,重慶市大足區(qū)(S3)綜合評(píng)價(jià)排名第3,而重慶市忠縣綜合評(píng)價(jià)排名第12。進(jìn)一步表明小根蒜的品質(zhì)表現(xiàn)出一定的地域和生境依賴性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分含量的HPLC法,所建立方法能使不同樣品中8個(gè)指標(biāo)成分均能得到良好分離,并且利用聚類分析和主成分分析方法對(duì)各地區(qū)小根蒜中含堿基和核苷的量給出了評(píng)價(jià),為后期的質(zhì)量評(píng)價(jià)及不同產(chǎn)地、不同部位的樣品分析提供一種可靠有效的手段。結(jié)果表明，38份不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分含量在線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(r>0.9995)，檢出限為10.78～37.62 ng·mL-1，定量限為35.81～115.28 ng·mL-1及平均回收率為97.72%～100.29%，RSD<3%。小根蒜不同部位均可檢測(cè)到8種堿基和核苷類成分，且不同產(chǎn)地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組成結(jié)構(gòu)比存在明顯的差異，部分非入藥、食用部位堿基和核苷含量高于其鱗莖。采用聚類分析能將不同產(chǎn)地的14份小根蒜鱗莖分為2類，且主成分分析法篩選出重慶市萬(wàn)州區(qū)質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)最好。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為小根蒜的高效合理利用提供了理論依據(jù)。