張春燕,吳美儒,周毅峰,唐巧玉,*

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室,湖北民族學(xué)院,湖北恩施 445000;2.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北民族學(xué)院,湖北恩施 445000)

莼菜(Braseniaschreberi)別名蹄草、水葵、露蔡、湖菜等,為睡蓮科莼菜屬中的栽培種,是一種多年生宿根水生草本蔬菜[1]。莼菜含有酸性多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等化學(xué)成分,有抗腫瘤、抗?jié)儭⒖咕缀痛龠M免疫等生物活性,具有營養(yǎng)、醫(yī)療和保健功效,為重要的野生經(jīng)濟植物[2]。

已有的研究表明,莼菜多糖具有降血糖、降血脂作用[3-5],對莼菜多糖結(jié)構(gòu)及功能性的深入研究有利于合理開發(fā)利用莼菜。因此,對于莼菜多糖的提取、分離和純化具有重要意義。莼菜粗多糖的提取工藝已有研究[6-7],而要得到有一定純度的多糖,首先需要通過初步分離純化除去共存的色素、蛋白等雜質(zhì)。多糖分離純化有多種方法,大孔樹脂法是一種常用的初步分離純化方法,具有穩(wěn)定性高、吸附容量大、適用范圍廣、再生處理方便等諸多優(yōu)點,因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[8-10]。目前,針對莼菜多糖進行大孔樹脂脫色的優(yōu)化實驗尚未見報道。

本文首先對不同類型的離子交換樹脂和吸附樹脂對莼菜多糖溶液脫色效果進行了考察,然后研究具有較好脫色效果的樹脂對莼菜多糖的脫色工藝條件,擬找出能夠生產(chǎn)高純度莼菜多糖的工藝,為莼菜多糖的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莼菜 湖北利川,經(jīng)脫膠[11]、60 ℃烘干、粉碎后過60目篩,即為莼菜粉,備用;大孔陰離子交換樹脂D301-G、大孔陽離子交換樹脂001×7、大孔吸附樹脂X-5、AB-8、NKA-9、NKA 天津南開大學(xué)化工廠;牛血清白蛋白(生化試劑) 南京奧生化學(xué)技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(G-250) 上海化學(xué)試劑公司;蒽酮、濃硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、95%乙醇 均為國產(chǎn)分析純。

HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;PHSJ-4A酸度計 上海雷磁儀器廠;TU-1810紫外/可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;PH-030A數(shù)顯恒溫干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;ALPHA1-4真空冷凍干燥機 德國Marin Chris公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 稱取5.000 g陰離子交換樹脂D301-G,用去離子水反復(fù)洗滌直至無泡沫為止,然后用5%鹽酸浸泡4 h,再用去離子水沖洗至中性,最后5% NaOH浸泡4 h,去離子水沖洗至pH8.0;稱取5.000 g陽離子交換樹脂001×7,用去離子水反復(fù)洗滌直至無泡沫為止,然后用5% NaOH浸泡4 h,再用去離子水沖洗至中性,最后用5% HCl浸泡4 h,去離子水沖洗至pH8.0;稱取5.000 g吸附樹脂X-5、AB-8,NKA-9、NKA,用5% HCl浸泡4 h,蒸餾水沖洗至pH6.0,然后用5% NaOH浸泡4 h,去離子水沖洗至pH8.0,最后用95%乙醇浸泡12 h蒸餾水清洗備用[12]。

1.2.2 莼菜多糖的提取 莼菜粉經(jīng)95%乙醇預(yù)處理脫去部分色素后,用55 ℃熱水?dāng)嚢杞? h,5000 r/min離心10 min,上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器55 ℃減壓濃縮,得到的濃縮粗多糖溶液用3倍體積95%乙醇沉淀,5000 r/min離心10 min收集沉淀,并進行冷凍干燥(-80 ℃)得到粗多糖,溶解備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 樹脂的篩選 分別向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、001X7、X-5、AB-8,NKA-9、NKA樹脂,再加入10 mL pH5.0的莼菜多糖溶液,用55 ℃的恒溫振蕩水浴振蕩2 h后過濾,測定各種樹脂對莼菜多糖脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率的影響。

1.2.3.2 pH對樹脂脫色效果的影晌 分別向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、AB-8、NKA-9樹脂,再加入10 mL pH為4、5、6、7和8的莼菜多糖溶液,用55 ℃恒溫振蕩水浴振蕩2h后過濾,測定不同樹脂在不同pH條件下對莼菜多糖脫色率的影響。

1.2.3.3 脫色溫度對樹脂脫色效果的影晌 分別向不同的三角瓶中加入1.0 g D301-G、AB-8、NKA-9樹脂,再加入10 mL pH為5.0的莼菜多糖溶液,在30、40、50、60、70 ℃恒溫振蕩水浴振蕩2h后過濾,測定不同樹脂在不同溫度下對莼菜多糖脫色率的影響。

1.2.4 正交設(shè)計確定脫色的最佳工藝條件 在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用正交實驗法確定茶多糖提取液的最佳脫色條件,按照四因素三水平L9(34)正交設(shè)計,見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 多糖含量的測定 采用蒽酮硫酸法[13]。取2 mL多糖溶液,加入8 mL 2 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液,混勻,沸水浴中加熱15 min,自來水冷卻至室溫,以蒸餾水代替多糖做空白參比,在625 nm波長處測定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到溶液的多糖含量。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮蘭G-250法[14]。取1 mL多糖溶液,加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液,混勻,以蒸餾水代替多糖溶液做空白參比,在595 nm波長處測定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到溶液的蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 相關(guān)指標(biāo)的計算

多糖保留率(%)=CF×100/CB(CB、CF分別為脫色前、脫色后的多糖含量)

蛋白質(zhì)去除率(%)=(CB-CF)×100/CF(CB、CF分別為脫色前、脫色后的蛋白質(zhì)含量)

脫色率(%)=(OD420B-OD420F)×100/ODF(OD420B、OD420F分別為脫色前、脫色后溶液在420 nm處的光密度值)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行實驗的平均值,實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)的形式表示,應(yīng)用Microsoft office excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進行分析作圖,SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的初篩選

從脫色率分析結(jié)果來看(表2～表3),在α=0.05的精度水平上,六種樹脂處理組間F值大于F臨界值,證明樹脂對莼菜多糖溶液脫色率有顯著的影響(p<0.05)。從各處理脫色率平均數(shù)分析來看,樹脂001×7與樹脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5對莼菜多糖溶液脫色率有顯著性差異(p<0.05),而樹脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5之間對莼菜多糖溶液脫色率并無顯著性差異(p>0.05),并且D301-G、AB-8、NKA-9三種樹脂對莼菜多糖溶液脫色率均達到了60%以上,其中NKA-9對莼菜多糖溶液脫色率達到最大值70.19%。

表2 脫色率的平均數(shù)分析(n=3,α=0.05)

表3 脫色率的方差分析(n=3,α=0.05)

從多糖保留率的方差分析來看(表4～表5),在α=0.01的精度水平上,六種樹脂處理組間F值遠遠大于F臨界值,p值為5×10-6,證明樹脂對莼菜多糖保留率有極顯著的影響(p<0.01)。從各處理多糖保留率的平均數(shù)分析來看,001×7與X-5、D301-G、AB-8、NKA-9、NKA對莼菜多糖保留率有極顯著性差異(p<0.01),D301-G、AB-8、NKA-9、NKA對莼菜多糖保留率并無極顯著性差異(p>0.01),其中001×7對莼菜多糖保留率達到最大值59.35%。

表4 多糖保留率的平均數(shù)分析(n=3,α=0.01)

表5 多糖保留率的方差分析(n=3,α=0.01)

從蛋白質(zhì)去除率的方差分析來看(表6～表7),在α=0.01的精度水平上,六種樹脂處理組間F值遠遠大于F臨界值,p值為7.68×10-5,證明樹脂對莼菜多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率有極顯著的影響(p<0.01)。從各處理蛋白質(zhì)去除率平均數(shù)分析來看,樹脂001×7與樹脂D301-G、AB-8、NKA-9、NKA、X-5對莼菜多糖溶液蛋白質(zhì)去除率有極顯著性差異(p<0.01),D301-G、AB-8、NKA-9、X-5對莼菜多糖溶液蛋白質(zhì)去除率并無極顯著性差異(p>0.01),并且D301-G、AB-8、NKA-9、X-5蛋白質(zhì)去除率均達到50%以上,其中AB-8對莼菜多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率達到最大值63.7%。

表6 蛋白質(zhì)去除率的平均數(shù)分析(n=3,α=0.01)

表7 蛋白質(zhì)去除率的方差分析

從脫色率、蛋白質(zhì)去除率、多糖保留率三個方面綜合考慮,篩選出D301-G、AB-8、NKA-9三種樹脂進行后續(xù)實驗研究。

2.2 pH對脫色效果的影晌

從圖1可以看出,樹脂種類不同,脫色的最適pH也不同。pH為4～8時,D301-G和NKA-9對多糖溶液的脫色率隨著pH的增大呈先上升后下降趨勢,均在pH=6左右達到較佳脫色效果;AB-8對多糖溶液的脫色率隨著pH的增大逐漸下降?？偟膩碚f,三種樹脂對莼菜多糖的脫色效果在酸性條件下比較好。綜合考慮pH對三種不同樹脂脫色效果的影響,選擇pH為4～6作為正交實驗的pH研究范圍。

圖1 pH對脫色效果的影響

2.3 溫度對脫色效果的影晌

由圖2可以看出,溫度對脫色率的影響較明顯。溫度在30～70 ℃時,隨著溫度的增大,NKA-9、AB-8對多糖溶液的脫色率都呈先上升后下降趨勢,當(dāng)溫度在一定范圍內(nèi)升高時,由于分子的擴散速度加快,多糖溶液的粘度下降,色素更易與樹脂吸附表面結(jié)合,但溫度超過一定范圍(>50 ℃),因色素與樹脂吸附作用力較弱,解吸也會加快,導(dǎo)致脫色率下降,D301-G對多糖溶液的脫色率30～60 ℃之間呈平穩(wěn)上升趨勢。因在50 ℃左右溫度條件下,三種樹脂的脫色效果都較好,故選擇45～55 ℃作為正交實驗的溫度范圍。

圖2 溫度對脫色效果的影響

2.4 正交實驗確定脫色的最佳工藝條件

從正交實驗和極差分析表(表8)可看出，由R值可知,對脫色率來說,樹脂種類影響最大,溫度的影響次之,pH影響最小,這與莼菜多糖溶液中色素分子所帶的電荷、疏水性、極性、是否容易與吸附樹脂的表面基團形成氫鍵等有關(guān)。對多糖保留率來說,樹脂種類影響最大,pH的影響次之,溫度影響最小,這可能與莼菜多糖大多是堿溶性的酸性多糖有關(guān)。對蛋白質(zhì)去除率來說,溫度的影響較大,樹脂的種類次之,pH影響最小,這與進行樹脂種類篩選時測定的蛋白質(zhì)去除率相一致。由k值大小可知,以主要考察指標(biāo)脫色率進行衡量,優(yōu)化工藝組合為A2B1C3。采用優(yōu)化工藝組合A2B1C3即樹脂選用NKA-9、脫色pH為4和脫色溫度55 ℃對莼菜多糖脫色,得到多糖脫色率為79.22%,多糖保留率為67.54%,蛋白質(zhì)去除率55.75%,優(yōu)于正交實驗脫色最高組合A2B2C3。

表8 莼菜多糖溶液脫色正交實驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過正交實驗工藝優(yōu)化,得到了莼菜多糖大孔樹脂脫色的最佳工藝。采用NKA-9樹脂,在脫色溫度為55 ℃和脫色pH為4的條件下,莼菜多糖溶液的脫色率為79.22%,多糖保留率為67.54%,蛋白質(zhì)去除率為55.75%,莼菜多糖得到了初步純化,可采用離子交換層析和凝膠過濾層析對其進行進一步純化。