李 霞,熊 峰,覃獻(xiàn)杏,李家樹,崔萌佳,郝再彬,陳慧英,*

(1.廣西電磁化學(xué)功能物質(zhì)重點實驗室,廣西桂林 541004;2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西桂林 541004;3.桂林萬禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司,廣西桂林 541000)

西番蓮(PassifloraedulisSims)是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)草質(zhì)藤本植物,其果實又稱百香果、雞蛋果,廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國約有19種,現(xiàn)主要栽培于廣西、廣東、海南、福建、云南、臺灣等地區(qū)[1]。西番蓮果汁富含人體所需的氨基酸、多種維生素和β-類胡蘿卜素以及各種微量元素[2],其果皮也含有豐富的多糖、萜烯類、黃酮類、花色苷、膳食纖維和生物堿[3-5]。近年來,研究表明西番蓮果皮多糖具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗氧化和調(diào)節(jié)血糖血脂等作用[6-8]。西番蓮常取其果汁用于飲料、糖果等加工,而果皮作為廢棄物(果皮約占鮮果重60%左右),既造成資源大量的浪費(fèi),也污染環(huán)境。可資源化利用西番蓮果皮不僅有助于推動西番蓮種植和加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展,也將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

微波輔助提取技術(shù)具有受熱均勻、快速、高速、安全和節(jié)能等優(yōu)點,已被廣泛用于蘆薈皮、香蕉皮、橘皮和仙人掌皮等多糖的提取[9-12]。目前已有微波輔助提取西番蓮果皮中果膠多糖的報道[13-14]。本研究擬考察料液比、提取時間、微波功率等因素對西番蓮果皮多糖提取率的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,在此基礎(chǔ)之上對得到的多糖進(jìn)行體外抗氧化活性分析,為西番蓮果皮資源的綜合利用和開發(fā)提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮果皮 桂林萬禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司;抗壞血酸(VC) 分析純,廣東興華化學(xué)廠有限公司;葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、水楊酸、硫酸亞鐵等 分析純,西隴化工股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 生物試劑,東京化成工業(yè)株式會社。

XH-300A電腦微波超聲波組合合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;UV760CRT紫外可見分光光度計 上海傲譜分析儀器有限公司;RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;BSY-200T型多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司;DL-5-8型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波提取 取新鮮西番蓮果皮洗凈于50 ℃下烘干,粉碎過20目篩,80%的乙醇85 ℃冷凝回流提取3次,每次2 h,分離殘渣并干燥。稱取上述殘渣5 g,按照一定料液比加入蒸餾水,在一定功率下微波提取一定時間,抽濾,濾液3000 r/min,離心10 min,取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(45～50 ℃)濃縮至掛壁狀態(tài),加入4倍體積無水乙醇沉淀,4 ℃靜置48 h,4000 r/min,離心15 min,取沉淀冷凍干燥(-60 ℃),得到西番蓮果皮粗多糖。

1.2.3 提取工藝的單因素實驗

1.2.3.1 料液比對多糖提取率的影響 在微波功率420 W,提取時間3 min,提取1次的條件下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對西番蓮果皮多糖提取率的影響。

1.2.3.2 時間對多糖提取率的影響 在微波功率420 W,料液比1∶30 g/mL,提取1次的條件下,考察提取時間(1、2、3、4、5 min)對西番蓮果皮多糖提取率的影響。

1.2.3.3 功率對多糖提取率的影響 在料液比1∶30 g/mL,提取時間3 min,提取1次的條件下,考察微波功率(140、280、420、560、700 W)對西番蓮果皮多糖提取率的影響。

1.2.4 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以料液比(A)、提取時間(B)、微波功率(C)為自變量,多糖提取率為響應(yīng)量,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken優(yōu)化西番蓮果皮多糖的提取工藝,實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.5 傳統(tǒng)水浴提取對西番蓮果皮多糖提取率的影響 選取傳統(tǒng)水浴提取條件[6],在此基礎(chǔ)上設(shè)置西番蓮果皮多糖提取條件,料液比1∶27 g/mL,在90 ℃水浴鍋中浸提120 min,測定多糖提取率,平行3次。

1.2.6 西番蓮果皮多糖體外抗氧化活性實驗 通過測定西番蓮果皮多糖對DPPH、超氧陰離子自由基的清除能力來判斷西番蓮果皮多糖的抗氧化活性。將VC和粗多糖粉末分別用去離子水配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度。以配制的多糖樣品溶液濃度為橫坐標(biāo),清除率為縱坐標(biāo),繪制不同梯度多糖溶液的抗氧化活性曲線。

在高中史料教學(xué)中，為了讓學(xué)生能夠?qū)κ妨蟽?nèi)容進(jìn)行正確了解，就需要學(xué)生將史料與作者的立場、人們的觀點、社會背景以及所處時代相結(jié)合，并圍繞教學(xué)目的對史料內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)充。在史料教學(xué)中，不僅能夠?qū)W(xué)生的思維能力與學(xué)習(xí)能力進(jìn)行培養(yǎng)與提高，還能夠讓學(xué)生從歷史角度對歷史事件進(jìn)行評論。史料的選擇應(yīng)該適合、適量，使其能夠與課程內(nèi)容相平衡，這樣才能夠有效提高歷史教學(xué)質(zhì)量。

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 量取配制的已知濃度的待測樣品液2.0 mL,加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液(無水乙醇作為溶劑),充分混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min,在波長517 nm處測定其吸光度Ai,同時測定無水乙醇(2.0 mL)與DPPH(2.0 mL)混合液的吸光度AC,無水乙醇(2.0 mL)和樣品液(2.0 mL)混合液的吸光度Aj,在其他條件不變下,以VC替換多糖作為陽性對照[16]。則DPPH自由基清除率計算公式如下:

K(%)=[1-(Ai-Aj)/AC]×100

1.2.6.2 羥基自由基清除能力測定 取1 mL的FeSO4溶液(10 mmol/L)于試管中,加入1 mL的水楊酸-乙醇溶液(10 mmol/L),搖勻后加入1 mL多糖已知濃度的樣品液,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動反應(yīng),37 ℃,水浴1 h,冷卻至室溫,在波長510 nm測吸光度。在其他條件不變下,以VC替換多糖作為陽性對照[17]。則羥基自由基清除率計算公式如下:

K(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1為蒸餾水代替多糖做空白;A2為樣品液;A3為蒸餾水代替H2O2的多糖本底溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件、Origin 8.0軟件對單因素實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析;用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行實驗結(jié)果分析和自由基清除率IC50計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)Bedam Y et al對黃色西番蓮果皮果膠多糖進(jìn)行單糖測定,其主要單糖組成為葡萄糖和木糖[18]。以混合糖繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.004X+0.075,R2=0.999,在多糖含量為20～100 μg時具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對西番蓮果皮多糖提取率的影響 設(shè)置料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL,研究料液比對西番蓮果皮多糖提取率的影響,結(jié)果見圖1。多糖提取率隨料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在料液比為1∶30 g/mL時，多糖的提取率達(dá)到最高,為14.09%。由于料液比增大，導(dǎo)致內(nèi)部植物細(xì)胞和外部溶劑之間的濃度差越大,致使多糖的傳質(zhì)驅(qū)動力越大。但當(dāng)液料比高于1∶30 g/mL后,曲線下降,意味著溶劑與材料比例的進(jìn)一步增加,不會增加多糖的提取率,這可能是因為溶劑與材料的比例越高,擴(kuò)散內(nèi)部組織距離越長,并在傳輸過程中造成損失。因此,選擇微波輔助提取西番蓮果皮多糖的料液比為1∶30 g/mL。

圖1 料液比對西番蓮果皮多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間對西番蓮果皮多糖提取率的影響 設(shè)置提取時間為1、2、3、4、5 min,研究提取時間對西番蓮果皮多糖提取率的影響,結(jié)果見圖2。多糖提取率隨提取時間的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。長時間提取有助于液體滲入原料的釋放介質(zhì),溶解多糖并隨后從原料中擴(kuò)散出來。當(dāng)提取時間達(dá)到3 min時,提取率達(dá)到最大。繼續(xù)增加提取時間,導(dǎo)致多糖的降解和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的產(chǎn)生而使提取率下降。因此,選擇微波輔助提取西番蓮果皮多糖的提取時間為3 min。

圖2 提取時間對西番蓮果皮多糖提取率的影響

2.2.3 微波功率對西番蓮果皮多糖提取率的影響 設(shè)置微波功率為140、280、420、560、700 W,研究微波功率對西番蓮果皮多糖提取率的影響,結(jié)果見圖3。多糖提取率隨著微波功率的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)微波功率達(dá)到420 W時,提取率達(dá)到最大。繼續(xù)提高功率,多糖提取率下降,原因是由于微波功率過大造成溫度過高,使部分多糖發(fā)生降解。因此,選擇微波輔助提取西番蓮果皮多糖的微波功率為420 W。

圖3 微波功率對西番蓮果皮多糖提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立和分析 在單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇料液比(A)、提取時間(B)、微波功率(C)作為影響因素,多糖提取率為響應(yīng)值Y,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計的實驗條件和西番蓮果皮多糖提取率如表2所示。

表2 RSM實驗設(shè)計及結(jié)果

西番蓮果皮多糖提取率為11.51%～14.15%,對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合,得回歸方程:Y=14.05-0.25A+0.42B+0.46C-0.02AB+0.05AC-0.84BC-0.43A2-0.25B2-0.55C2。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果(表3)顯示模型的p<0.0001,表明回歸模型顯著;失擬項p=0.059>0.05,不顯著?；貧w方程模型相關(guān)系數(shù)R2=0.991,模型的調(diào)整R2=0.979,該模型能夠解釋97.9%的響應(yīng)值變化,說明模型與實際實驗擬合度較好,實驗誤差較小,可信度較高，表明該模型能夠很好對西番蓮果皮多糖的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。由表3可知,回歸模型中一次項A、B、C及交互項BC影響極顯著(p<0.01),平方項A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),由此可見,微波功率、提取時間和料液比對西番蓮果皮多糖的提取率都有極顯著影響(p<0.01)。由方差分析中各因素的F值大小反映各因素對實驗指標(biāo)的影響程度,各因素對多糖的影響大小依次為:微波功率(C)>提取時間(B)>料液比(A)。

表3 RSM回歸模型方差分析結(jié)果

料液比、提取時間和微波功率這三個因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面與等高線圖見圖4,A、B和C的二次項系數(shù)均為負(fù)值,表明方程拋物線開口向下有最大值,即為響應(yīng)面的最高點,亦為等高線最內(nèi)橢圓的中心點[19]。等高線的形狀也反映交互作用的強(qiáng)弱,等高線越接近于圓形,顯著程度越弱,形狀越接近于橢圓形,則表示交互作用越顯著。通過對響應(yīng)面陡峭程度分析,微波功率對多糖提取率的影響最大,其次是提取時間和料液比。通過對等高線的分析發(fā)現(xiàn),微波功率和料液比提取時間的等高線為橢圓形,說明這兩個因素交互作用顯著,而微波功率和料液比的等高線與料液比和提取時間的等高線為圓形,所以微波功率和料液比交互作用不顯著,料液比和提取時間交互作用不顯著。這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 因素間的交互作用對西番蓮果皮多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

2.3.2 驗證實驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件計算所得西番蓮果皮多糖微波提取的最佳條件為:料液比1∶26.87 g/mL,提取時間3.38 min,微波功率406.43 W,在此條件下預(yù)測的多糖提取率為14.23%?？紤]到實驗的可操作性,取料液比1∶27 g/mL,提取時間3.4 min,微波功率420 W,在此條件下平行3次驗證實驗,多糖提取率為14.12%±0.42%,相對偏差較小且與預(yù)測值接近,工藝條件穩(wěn)定可行。

2.3.3 傳統(tǒng)水浴提取與微波輔助提取對多糖提取率的比較 分別在傳統(tǒng)水浴提取/微波輔助提取最佳工藝條件下提取西番蓮果皮多糖,進(jìn)行3次平行實驗,比較傳統(tǒng)水浴提取法與微波輔助提取法對西番蓮果皮多糖提取率的影響,結(jié)果見表4。

表4 不同提取方法對西番蓮果皮多糖提取率影響

由表4可知,在相同的料液比條件下,微波輔助提取多糖提取率是傳統(tǒng)水浴提取的1.5倍。由于微波提取具有升溫快速、萃取效率高,更能有效破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),在短時間內(nèi)加速西番蓮果皮多糖的釋放,從而提高多糖的提取率。姜曼[20]采用微波輔助提取玫瑰花多糖提取率是其傳統(tǒng)水浴提取1.1倍,而提取時間卻為傳統(tǒng)水浴時間的1/60。因此,與傳統(tǒng)水浴相比,微波輔助提取技術(shù)具有明顯的省時、高效優(yōu)點。

2.4 體外抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH自由基清除能力 西番蓮果皮多糖對DPPH自由基的清除率見圖5。在濃度為0.1～1.0 mg/mL時,西番蓮果皮粗多糖對DPPH·的清除能力在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng),且隨著濃度的增大而提高,但在此濃度(0.1～1.0 mg/mL)范圍內(nèi),VC對DPPH·的清除率較穩(wěn)定,均在90%以上。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時,西番蓮果皮多糖對DPPH·的清除率為74.02%,其IC50值分別為0.374 mg/mL。Silva等[21]對西番蓮葉的水提物進(jìn)行DPPH·清除實驗,IC50值為1.1 mg/mL,IC50值越低,其清除效果越好。與西番蓮葉的水提物相比,西番蓮果皮多糖對DPPH·的清除力相對較強(qiáng)。

圖5 西番蓮果皮多糖對DPPH·清除作用

2.4.2 羥基自由基清除能力 西番蓮果皮多糖對·OH的清除率見圖6。西番蓮果皮粗多糖對·OH的清除能力隨著濃度的增大而提高,當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時,西番蓮果皮多糖清除率為14.41%,其IC50值為61.06 mg/mL。文良娟等[22]采用·OH清除率測定其西番蓮果皮水提物的抗氧化活性,當(dāng)濃度為5.4 mg/mL時,清除率為77.33%,表明在一定濃度范圍內(nèi),西番蓮果皮多糖的濃度與·OH的清除率呈正相關(guān)。

圖6 西番蓮果皮粗多糖對·OH清除作用

3 結(jié)論

本研究采用微波輔助提取西番蓮果皮中多糖,在單因素實驗基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken實驗設(shè)計,建立西番蓮果皮多糖提取率的二次回歸模型,優(yōu)化最佳工藝條件為:料液比1∶27 g/mL,提取時間3.4 min,微波功率420 W條件下,此條件下的西番蓮果皮多糖提取率為14.12%±0.42%。這與響應(yīng)面模型方程理論值接近,說明該模型能較好地預(yù)測實際提取率。此外,通過體外抗氧化實驗充分證明了西番蓮果皮多糖具有一定的抗氧化活性。在一定濃度范圍內(nèi),西番蓮果皮粗多糖與DPPH·和·OH的清除率存在一定量效關(guān)系,當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時,DPPH·和·OH的清除率分別為74.02%和14.41%?？梢?微波輔助提取西番蓮果皮多糖提取率較高、抗氧化能力較強(qiáng),不僅具有作為功能成分在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用的潛力,也為資源化利用西番蓮果皮提供思路和理論依據(jù)。