章 中,孫 靜,張津瑜,郭洪偉,賀曉光

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

芽孢是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件下形成的休眠態(tài),對(duì)輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學(xué)物質(zhì)等各種殺菌處理有極強(qiáng)的抗性[1-4]。高壓熱殺菌處理(HPTS)將超高壓和溫度耦合起來殺菌,對(duì)細(xì)菌芽孢有良好的殺滅作用,且對(duì)食品品質(zhì)影響較小[5-6]。Uchida等[7]報(bào)道HPTS(600 MPa、65 ℃)能殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢。Ates等[8]報(bào)道HPTS(650 MPa、65 ℃、10 min)能殺滅4.5個(gè)對(duì)數(shù)的枯草芽孢桿菌芽孢。Evelyn等[9]報(bào)道:HPTS(400～600 MPa、70 ℃)能殺滅牛奶中的蠟樣芽孢桿菌芽孢,Weibull模型能很好地描述芽孢死亡動(dòng)力學(xué)。Luu-Thi等[10]報(bào)道HPTS(300～600 MPa、60～100 ℃)能殺滅蠟樣芽孢桿菌芽孢,HPTS處理下初期芽孢死亡較快、后期較慢,但兩個(gè)階段均可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述。HPTS對(duì)芽孢的殺滅作用和殺菌動(dòng)力學(xué)已有廣泛報(bào)道,但關(guān)于HPTS殺滅芽孢的機(jī)理卻鮮有報(bào)道。芽孢的皮層是其耐壓特性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),皮層主要由肽聚糖構(gòu)成,前期研究發(fā)現(xiàn)HPTS處理下細(xì)菌芽孢皮層肽聚糖發(fā)生了水解[1],這是導(dǎo)致芽孢死亡的重要原因之一,然而其水解機(jī)理尚不明確,存在兩種僅有的可能性:其一是HPTS能激活芽孢自身的皮層裂解酶,其二是HPTS未能激活皮層裂解酶,而其是芽孢中唯一能特異性地水解皮層肽聚糖的酶[1],即HPTS能導(dǎo)致皮層肽聚糖的非酶水解。

在休眠的芽孢中,皮層裂解酶不表現(xiàn)出活性,但在芽孢萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營(yíng)養(yǎng)體的過程中,皮層裂解酶通過某種機(jī)制被激活并將皮層肽聚糖水解,這是芽孢萌發(fā)過程中的一個(gè)重要步驟[11]。Reineke等[12]認(rèn)為HPTS可能會(huì)影響皮層裂解酶的活性,在一定壓力和溫度條件下,皮層裂解酶可能會(huì)被激活,導(dǎo)致芽孢皮層水解,進(jìn)而使得芽孢結(jié)構(gòu)被破壞。Mathys等[13]認(rèn)為,HPTS處理下芽孢內(nèi)部的2、6-吡啶二羧酸(DPA)的釋放可能會(huì)激活皮層裂解酶,從而將芽孢皮層水解,進(jìn)而導(dǎo)致芽孢死亡。關(guān)于壓力和溫度對(duì)酶蛋白構(gòu)象影響的報(bào)道很多[14-16],但未見有關(guān)溫度和壓力對(duì)芽孢皮層裂解酶活力影響的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的芽孢中提取皮層裂解酶,研究溫度、pH、磷酸鈉濃度、壓力和HPTS對(duì)芽孢皮層裂解酶活力的影響,以分析HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖的水解機(jī)理,進(jìn)一步闡明HPTS殺滅芽孢的機(jī)理,夯實(shí)HPTS技術(shù)在食品工業(yè)中應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 編號(hào)As 1.433;促芽孢生長(zhǎng)錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 向普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入MnSO4·H2O(使得培養(yǎng)基中Mn2+的濃度為50 mg/L),調(diào)pH至7,滅菌,備用;2,6-吡啶二羧酸(DPA) 分析純,美國(guó)Sigma公司;L-丙氨酸、肌苷 上海瑞永生物科技有限公司;其它化學(xué)試劑 均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DSX-280B型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;XMTD-6000型電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;GL-10C型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;722型可見分光光度計(jì) 上海馳唐電子有限公司;FE28型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Agilent 1100型HPLC色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái) 美國(guó)Agilent公司;Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)Welch公司;UV-2450型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枯草桿菌芽孢菌懸液的制備 芽孢的制備參照Gao[17]的方法。枯草芽孢桿菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化3代以上后,接入促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基試管斜面上劃線培養(yǎng),經(jīng)37 ℃培養(yǎng)7 d后,用無(wú)菌去離子水將試管斜面上的芽孢洗滌收集到離心管里,然后用冷的無(wú)菌去離子水離心洗滌芽孢三次,離心條件為7000×g、4 ℃、15 min,離心后將上清液和沉淀的上部一起倒掉,洗滌后的芽孢重懸在無(wú)菌去離子水中,濃度約為1.5×109CFU/mL,放在4 ℃下保存,一個(gè)月內(nèi)使用。

1.2.2 脫芽孢衣芽孢的制備 脫芽孢衣芽孢的制備參照Gombas[18]的方法。將枯草桿菌芽孢用30 mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.2 mol/L 2-巰基乙醇、0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=10.0)在40 ℃下處理8 h,再用蒸餾水徹底洗干凈。

1.2.3 芽孢萌發(fā)處理 萌發(fā)處理參照Miyata[19]和Makino[20]的方法。將枯草桿菌芽孢懸浮液(0.1 g/mL)在65 ℃下熱激活45 min,然后在冰水中冷卻,再經(jīng)離心(7000×g、4 ℃、15 min)沉淀后,將芽孢置于10倍體積的、pH為7.0的、30 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中,于32 ℃下萌發(fā),磷酸鈉緩沖液中含有10 mmol/L的L-丙氨酸和4 mmol/L的肌苷。通過測(cè)定芽孢懸浮液OD600值的變化來判斷萌發(fā)的情況。

1.2.4 皮層裂解酶提取 皮層裂解酶提取參照Gombas[18]和Makino[20]的方法。在萌發(fā)處理后,將芽孢懸浮液離心(8000×g、4 ℃、10 min),取上清液(50 mL)在4 ℃透析處理2次,每次24 h,透析對(duì)照液為2 L、0.05 mol/L、pH=7.0的磷酸鈉緩沖液,緩沖液中含有1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)和1 mmol/L的巰基乙酸鈉。

1.2.5 皮層裂解酶活性分析 皮層裂解酶會(huì)導(dǎo)致脫芽孢衣芽孢萌發(fā)[19]。芽孢萌發(fā)時(shí),其核心部分水化,導(dǎo)致其折光性發(fā)生變化,表現(xiàn)為脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值顯著下降,下降程度越高,芽孢的萌發(fā)率就越高,皮層裂解酶活性也就越高[21]。皮層裂解酶的活性分析參照Miyata[19]和Makino[20]的方法。在32 ℃下,通過測(cè)定1 cm光路內(nèi)脫除芽孢衣的芽孢懸浮液的OD600值的減少量來評(píng)價(jià)酶的活性。反應(yīng)混合物最終體積為5 mL,包含1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液和4 mL酶液,酶液包含0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)、1 mmol/L的EDTA和1 mmol/L的巰基乙酸鈉。酶活性單位(U/L)定義為:每分鐘OD600值降低0.001所需的酶量。計(jì)算公式為:

式中:X為酶活(U/L),t為反應(yīng)時(shí)間(min),V為參與反應(yīng)的酶量(mL)。

1.2.6 RP-HPLC法檢測(cè)DPA DPA檢測(cè)參照Fichtel[22]的方法。使用C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流動(dòng)相是20%的甲醇和80%的磷酸氫鈉溶液(濃度為50 mmol/L,用磷酸調(diào)整pH至2.5),流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm。

1.2.7 各因素對(duì)皮層裂解酶活力的影響

1.2.7.1 溫度對(duì)皮層裂解酶活力的影響 取4 mL透析后的酶液,酶液包含0.05 mol/L、pH為7.0磷酸鈉緩沖液,分別于4、12、20、28、36、44、68 ℃培育20 min,對(duì)照組為4 mL無(wú)菌水在常溫下放置20 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應(yīng),每10 min測(cè)一次OD600值,根據(jù)80 min內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

1.2.7.2 pH對(duì)皮層裂解酶活力的影響 分別調(diào)整酶液pH為4、5、6、7、8、9、10,酶液包含0.05 mol/L的磷酸鈉緩沖液,再各取4 mL酶液,對(duì)照組取4 mL無(wú)菌水,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應(yīng),每10 min測(cè)一次OD600值,根據(jù)80 min內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

1.2.7.3 磷酸鈉濃度對(duì)皮層裂解酶活力的影響 將透析后酶液中的磷酸鈉濃度分別調(diào)整為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mol/L,酶液pH為7,再取4 mL酶液,對(duì)照組為4 mL無(wú)菌水,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應(yīng),每10 min測(cè)一次OD600值,根據(jù)80 min內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

1.2.7.4 壓力對(duì)皮層裂解酶活力的影響 將透析后的酶液(包含0.05 mol/L、pH=7.0磷酸鈉緩沖液)分別于常壓、150、200、250、300、350、400、450、530 MPa下處理15 min,取處理后的酶液4 mL,對(duì)照組為4 mL無(wú)菌水在常壓放置15 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應(yīng),每10 min測(cè)一次OD600值,根據(jù)80 min內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

1.2.7.5 HPTS處理對(duì)皮層裂解酶活力的影響 將磷酸鈉濃度為0.05、0.35 mol/L的兩種透析后的酶液于530 MPa、68 ℃下處理15 min,取處理后的酶液4 mL,對(duì)照組為4 mL透析后的酶液和4 mL無(wú)菌水在常溫常壓下放置15 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應(yīng),每10 min測(cè)一次OD600值,根據(jù)80 min內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢皮層裂解酶提取液中DPA測(cè)定

芽孢萌發(fā)滲出物中不但有皮層裂解酶,也有DPA,而DPA也會(huì)誘導(dǎo)芽孢萌發(fā),從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為此通過透析處理來去除皮層裂解酶提取液中的DPA。通過全波段掃描可以看出在272.5 nm處DPA有最大吸收峰,因此選取272 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由圖1b～c可知,DPA的出峰時(shí)間為4.64 min,而透析后的皮層裂解酶提取物僅在2.37 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)峰,說明透析處理已將酶液中的DPA完全去除。

圖1 芽孢皮層裂解酶提取液中DPA含量分析

2.2 溫度對(duì)皮層裂解酶活力的影響

由圖2可知,在4～44 ℃溫度范圍內(nèi)時(shí),芽孢懸浮液的OD600值與對(duì)照組相比，均顯著下降(p<0.05),說明皮層裂解酶仍具活力,但是在此溫度范圍內(nèi),皮層裂解酶活力的變化并沒有明顯規(guī)律。而當(dāng)溫度升至68 ℃時(shí),芽孢懸浮液OD600值與對(duì)照組基本沒有變化,說明皮層裂解酶基本失活。Makino等[20]研究發(fā)現(xiàn),60 ℃處理2 min或者45 ℃處理10 min時(shí),分離出的皮層裂解酶就已經(jīng)完全失活。Ando等[23]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)處理溫度為45 ℃時(shí)皮層裂解酶活力最強(qiáng),而當(dāng)處理溫度為60 ℃時(shí)酶活顯著降低,處理時(shí)間為20 min時(shí)酶完全失活。這些研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有細(xì)微差異,這可能與菌種有關(guān),菌種不同,皮層裂解酶的分子量、分子結(jié)構(gòu)不同,對(duì)溫度的耐受程度也不同,但以上研究報(bào)道均表明,60 ℃以上的熱處理會(huì)造成皮層裂解酶失活。

圖2 溫度對(duì)皮層裂解酶活力的影響

2.3 pH對(duì)皮層裂解酶活力的影響

由圖3可知,皮層裂解酶對(duì)pH非常敏感,當(dāng)pH為4～7時(shí),隨著pH的增大,芽孢懸浮液OD600值與對(duì)照組相比，下降幅度逐漸增大,說明皮層裂解酶活力逐漸增強(qiáng);而當(dāng)pH為7～10時(shí),隨著pH的增大,OD600值與對(duì)照組相比，下降幅度逐漸減小,說明皮層裂解酶活力逐漸降低。當(dāng)pH為7時(shí),OD600值的下降幅度最大,說明皮層裂解酶的活力最強(qiáng)。Miyata等[19]研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)pH為7.2～8.4時(shí),皮層裂解酶活力最佳,隨著pH的減小，皮層裂解酶活力逐漸降低，當(dāng)pH為3.4時(shí)，皮層裂解酶活力最低,這一研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在研究其它因素對(duì)皮層裂解酶活力的影響時(shí),將酶液的pH調(diào)整為7,以避免其對(duì)酶活的影響。

圖3 pH對(duì)皮層裂解酶活力的影響

2.4 磷酸鈉濃度對(duì)皮層裂解酶活力的影響

由2.3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,pH是影響酶活性的一個(gè)重要因素,為維持穩(wěn)定的pH,選用磷酸鈉緩沖液,因此研究了磷酸鈉濃度對(duì)皮層裂解酶活性的影響。由圖4可知,隨著磷酸鈉濃度的增大,芽孢懸浮液OD600值與對(duì)照組相比，下降幅度變小,說明皮層裂解酶的活力逐漸降低。當(dāng)磷酸鈉濃度為0.05 mol/L時(shí),OD600值與對(duì)照組相比，下降幅度最大,說明皮層裂解酶最具活力。而當(dāng)磷酸鈉濃度為0.35 mol/L時(shí),皮層裂解酶活性最小。這可能是由于該酶的催化部位對(duì)離子濃度非常敏感,離子濃度對(duì)形成精確的三維結(jié)構(gòu)位點(diǎn)起著重要作用[20],而高濃度鈉鹽形成的高滲透壓作用及離子間靜電作用破壞了某些酶結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致酶活性降低[24]。在研究其它因素對(duì)皮層裂解酶活力的影響時(shí),將磷酸鈉濃度調(diào)整為0.05 mol/L,以避免其對(duì)酶活的影響。

圖4 磷酸鈉濃度對(duì)皮層裂解酶活力的影響

2.5 壓力對(duì)皮層裂解酶活力的影響

由圖5可知,隨時(shí)間增加，各處理壓力下,芽孢懸浮液OD600值呈不斷下降趨勢(shì),處理壓力較低時(shí)，芽孢懸浮液OD600值與對(duì)照組相比下降速度較快,最終下降幅度較大。較常壓相比,150、200 MPa下皮層裂解酶活力有所增強(qiáng),當(dāng)壓力超過300 MPa時(shí),皮層裂解酶活力逐漸降低,但仍無(wú)法滅活皮層裂解酶。有報(bào)道稱超高壓會(huì)改變酶的活力,郝夢(mèng)甄等[25]研究發(fā)現(xiàn)在較低壓力范圍內(nèi),隨著壓力的升高,海參體壁粗酶的酶活逐漸升高,250 MPa處理時(shí),酶活達(dá)到最高值。陳發(fā)慶等[26]研究超高壓對(duì)核桃多酚氧化酶和過氧化物酶的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)壓力在200 MPa以下時(shí),多酚氧化酶和過氧化物酶的活力隨著壓力升高而增大,但當(dāng)壓力超過200 MPa時(shí),兩種酶的活力隨壓力升高而逐漸減小。在超高壓處理下,不同酶的活力變化是不同的,這是由于酶的種類和分子結(jié)構(gòu)等不同而造成的。

圖5 壓力對(duì)皮層裂解酶活力的影響

2.6 HPTS處理對(duì)皮層裂解酶活力的影響

由2.4中結(jié)果可知,0.05 mol/L磷酸鈉濃度對(duì)皮層裂解酶活力影響最小,為進(jìn)一步排除磷酸鈉濃度對(duì)HPTS殺滅芽孢效果的影響,選用高純水制備芽孢懸浮液以模擬天然的HPTS殺菌環(huán)境,發(fā)現(xiàn)HPTS處理下0.05 mol/L磷酸鈉溶液(pH=7.0)中的芽孢死亡率和高純水中芽孢死亡率無(wú)顯著差異(p>0.05)。由圖6可知,經(jīng)530 MPa、68 ℃處理15 min后,0.05 mol/L磷酸鈉溶液(pH=7.0)中的皮層裂解酶基本失活,表現(xiàn)為芽孢懸浮液OD600值基本無(wú)變化。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]:隨壓力和溫度的變化,以壓力和溫度為橫、縱坐標(biāo),酶構(gòu)象和活力的變化呈現(xiàn)出一個(gè)橢圓形區(qū)域,在這個(gè)橢圓形區(qū)域內(nèi)酶有活力,而在這個(gè)橢圓形區(qū)域外酶失活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在530 MPa和68 ℃下,皮層裂解酶位于失活區(qū)域,HPTS處理不但沒有激活皮層裂解酶,反而使得皮層裂解酶失去了活性,由此可推測(cè)HPTS處理下,芽孢皮層肽聚糖的水解方式是非酶水解,這對(duì)揭示HPTS殺滅細(xì)菌芽孢的機(jī)理有重要意義。

圖6 HPTS處理對(duì)皮層裂解酶活力的影響

3 結(jié)論

本文研究了磷酸鈉濃度、pH、溫度和壓力對(duì)枯草桿菌芽孢皮層裂解酶活力的影響,在此基礎(chǔ)上研究了HPTS對(duì)該酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),皮層裂解酶的最適磷酸鈉濃度為0.05 mol/L,當(dāng)磷酸鈉濃度為0.35 mol/L時(shí),皮層裂解酶活力較低;最適pH為7,偏酸或偏堿性條件下,活力均有所降低;溫度升至68 ℃時(shí)皮層裂解酶基本失活;在150～530 MPa壓力范圍內(nèi),壓力對(duì)皮層裂解酶活性基本無(wú)影響,然而HPTS處理時(shí)(530 MPa、68 ℃、15 min),皮層裂解酶基本失活。HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖水解機(jī)理僅有兩種可能性,其一是HPTS激活皮層裂解酶,其二是HPTS導(dǎo)致皮層肽聚糖的非酶水解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HPTS處理不但沒能激活皮層裂解酶,反而導(dǎo)致了該酶的失活,由此可推測(cè)HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖的水解方式是非酶水解。本實(shí)驗(yàn)推進(jìn)了對(duì)HPTS殺滅芽孢機(jī)理的理解,有助于HPTS技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。