蒙月月,陸婧婧,占 萌,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

免疫力是人體自身的防御機(jī)制,是人體識(shí)別和消滅外來(lái)侵入機(jī)體的病毒、細(xì)菌等異物,識(shí)別和處理?yè)p傷、變性、衰老、死亡的自身細(xì)胞以及突變和病毒感染細(xì)胞的能力。免疫力低下是當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷,抵抗疾病能力下降,易導(dǎo)致細(xì)菌、病毒等入侵,從而危害人體健康的狀態(tài)[1-3]。益生菌是指具備生物活性,攝入一定數(shù)量時(shí)可以改善和調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生物菌群的平衡,對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益作用的微生物[4]。乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是能夠發(fā)酵糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大量乳酸的一類(lèi)呈球狀或桿狀、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng),是益生菌中最具有代表性的菌屬[5-6]。乳酸菌主要包括乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬及腸球菌屬等,廣泛分布在水果、蔬菜、乳、肉以及植物制品中,此外,在人體的胃腸、口腔中也有發(fā)現(xiàn)[7-8]。植物乳桿菌屬于乳桿菌屬,因多數(shù)從植物中分離而得名[9]。作為一類(lèi)人體和動(dòng)物腸道中正常菌群的益生乳酸菌,植物乳桿菌不僅具有維持體內(nèi)微生態(tài)平衡的作用,還具有免疫調(diào)節(jié)功能,例如能夠提高脾淋巴細(xì)胞增殖活性以及調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞、Th17/Treg細(xì)胞平衡[10-13]。

然而,人體胃液的強(qiáng)酸性以及腸道的膽鹽會(huì)嚴(yán)重影響植物乳桿菌的存活能力,植物乳桿菌能在人體內(nèi)發(fā)揮其益生功效的菌體濃度一般是106～109CFU/mL[14]。因此,乳酸菌能否抵御機(jī)體低pH的胃酸環(huán)境和腸道內(nèi)高滲透壓的膽鹽環(huán)境是其在機(jī)體內(nèi)存活的關(guān)鍵和發(fā)揮益生作用的前提[15]。本研究以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS 1.0318為研究對(duì)象,旨在評(píng)價(jià)其作為潛在益生乳桿菌的可能性,研究其生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸速率、耐酸、耐膽鹽能力及免疫活性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS1.0318 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;雌性BALB/c小鼠 清潔級(jí),6～8周齡,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK2012-0001,鼠房保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2) ℃,每天人工燈光照明12 h,標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng),自由飲用蒸餾水;大小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司;牛膽鹽 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;10×磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS) 北京索萊寶科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)液 美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清 Vitrocell公司;刀豆蛋白(ConA)、臺(tái)盼藍(lán)染色液、中性紅染色液、紅細(xì)胞裂解液、Hank’s液 Solarbio公司;CCK-8 日本同仁化學(xué)研究所;蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖等其他試劑 分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HF90型CO2培養(yǎng)箱 香港力康發(fā)展有限公司;Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Beckman公司;PL2002型、AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-25型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Lambda Bio35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elme公司;20～200、100～1000 μL可調(diào)定量移液槍 德國(guó)Eppendorf公司;96孔培養(yǎng)板 美國(guó)NEST公司;AE-30倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;VD-1320型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;LD4-2型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 Man-Rogosa-Sharp(MRS)培養(yǎng)基。具體配制方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將活化后的植物乳桿菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),并在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值(OD600),繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 產(chǎn)酸性實(shí)驗(yàn) 植物乳桿菌KLDS 1.0318經(jīng)活化后,按2%(v/v)的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,用pH計(jì)測(cè)定其pH。

1.2.4 耐酸性實(shí)驗(yàn) 用0.1 mol/L的鹽酸將MRS液體培養(yǎng)基的pH調(diào)整至1.5、2.5和3.5,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,冷卻備用。將活化后的植物乳桿菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接種量分別接種到上述處理后的培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng),分別于0、1、2、3 h取樣,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。按下列公式計(jì)算存活率[17]。

近日（8月27日-8月31日），中國(guó)化肥批發(fā)價(jià)格綜合指數(shù)持穩(wěn)運(yùn)行。9月3日中國(guó)化肥批發(fā)價(jià)格綜合指數(shù)（CFCI）為 2193.41點(diǎn)，環(huán)比上漲8.48點(diǎn)，漲幅為0.39%；同比上漲288.24點(diǎn)，漲幅為15.13%；比基期下跌185.46點(diǎn)，跌幅為7.80%。

式(1)

1.2.5 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 在MRS液體培養(yǎng)基中加入牛膽鹽,使膽鹽的質(zhì)量濃度分別為0.03、0.3、0.5 g/100 mL,以不添加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,冷卻備用。將活化后的植物乳桿菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接種量接種到上述處理后的培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng),分別于0、1、2、3、4 h取樣,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。按式(1)計(jì)算存活率[17]。

1.2.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 菌懸液的制備 將實(shí)驗(yàn)菌株以2%(v/v)的接種量接種至MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期(12 h),將菌液在4 ℃條件下5000 r/min離心10 min后,用無(wú)菌0.01 mol/L、pH7.4 PBS重懸菌沉淀,重復(fù)兩次,棄去上清液,用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸菌沉淀,調(diào)整菌懸液濃度均為108CFU/mL,4 ℃冷藏備用。

1.2.6.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 頸椎脫臼處死小鼠后,放入盛有75%(v/v)乙醇的燒杯中浸泡3～5 min,在超凈臺(tái)上沿腹腔中線剪開(kāi)小鼠胸腔,無(wú)菌取出脾臟,將其置于200目不銹鋼網(wǎng)篩,網(wǎng)篩中央浸沒(méi)于盛有Hank’s液的平皿中,用無(wú)菌注射器芯研磨,用Hank’s液將網(wǎng)上剩余組織吹洗掉,收集脾臟組織懸液于無(wú)菌離心管中,1000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入2～3 mL紅細(xì)胞裂解液到洗過(guò)的細(xì)胞中,混勻后靜置2～3 min,待紅細(xì)胞完全破碎,以1000 r/min離心5 min后棄上清液,以除去血紅細(xì)胞,用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基離心洗滌細(xì)胞2次。收集細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞懸液用臺(tái)盼藍(lán)染色后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),確保活細(xì)胞比例不小于95%,計(jì)數(shù)后用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL用于實(shí)驗(yàn)[18]。

1.2.6.3 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)空白調(diào)零組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、乳酸菌對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示),使植物乳桿菌KLDS 1.0318與細(xì)胞分別以1∶1、10∶1、100∶1比例共同培養(yǎng))[19]。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。加樣混勻后,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入新鮮配制成CCK-8溶液20 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,振蕩溶解后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,根據(jù)下列公式計(jì)算脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值和脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值=OD1-OD2

式(2)

式中:OD1為實(shí)驗(yàn)組OD值;OD2為陰性對(duì)照組OD值。

式(3)

式中:OD1為實(shí)驗(yàn)組OD值;OD2為陽(yáng)性對(duì)照組OD值;OD3為乳酸菌OD值;PI>1時(shí)提示促進(jìn)增殖;PI<1時(shí)提示抑制增殖。

1.2.7 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 腹腔巨噬細(xì)胞的制備[20]:小鼠眼球放血,頸椎脫白處死后,置于75%(v/v)乙醇溶液中浸泡5 min(消毒皮膚,暴露出腹膜壁),酒精擦洗腹部后,用無(wú)菌注射器抽取10 mL Hank’s液注入腹腔中,輕柔敲打2 min,使腹腔巨噬細(xì)胞盡可能多地懸浮在液體中;另取一支注射器抽出腹腔懸液,收集于無(wú)菌離心管中,1000 r/min離心5 min,棄上清液;用RPMI-1640完全培養(yǎng)液吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),確?；罴?xì)胞比例不小于95%,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL用于實(shí)驗(yàn)。

巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力測(cè)定[21]:將巨噬細(xì)胞接種于96孔板(100 μL/孔),細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,棄去上清液,貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和終濃度分別為1×106、1×107、1×108CFU/mL的菌懸液各100 μL,使植物乳桿菌KLDS 1.0318與細(xì)胞分別以1∶1、10∶1、100∶1比例共同孵育,對(duì)照組加等體積的無(wú)菌水。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄去上清液,加入0.072%中性紅染色液100 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,棄去中性紅染色液,用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性紅溶液,之后加入200 μL/孔細(xì)胞裂解液(冰醋酸∶無(wú)水乙醇=1∶1,v/v),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,振蕩混勻,用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定光密度值。

1.2.8 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)巨噬細(xì)胞能量代謝水平的影響 將巨噬細(xì)胞接種于96孔板(100 μL/孔),細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,棄去上清液,貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL,再加入100 μL重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液的植物乳桿菌KLDS 1.0318,使菌懸液終濃度分別為1×106、1×107、1×108CFU/mL。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,加入20 μL/孔CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,振蕩混勻;然后在酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)定各孔吸光值。結(jié)果以O(shè)D值表示腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),采用Excel 2010軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及制圖,并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌KLDS 1.0318的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知,植物乳桿菌KLDS 1.0318在0～4 h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢,屬于遲緩期;在4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,活菌數(shù)迅速增長(zhǎng);在12 h后達(dá)到穩(wěn)定期,此階段活菌數(shù)變化不大;20 h后,活菌數(shù)有所下降,進(jìn)入衰亡期。菌株的OD600值與活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的變化趨勢(shì)基本吻合,在對(duì)數(shù)期末達(dá)到了8.821。

圖1 植物乳桿菌KLDS 1.0318的生長(zhǎng)曲線

2.2 產(chǎn)酸性實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)酸能力是乳酸菌活力良好的重要特征之一,由圖2可以看出,植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠在較短時(shí)間內(nèi)足量的產(chǎn)酸,使pH迅速降低,由最初的7.22逐漸下降,在12 h后降至4.16,顯示了其較好的產(chǎn)酸能力。

圖2 植物乳桿菌KLDS 1.0318的產(chǎn)酸性

2.3 耐酸性實(shí)驗(yàn)

由圖3可知,植物乳桿菌KLDS 1.0318在pH1.5條件下活菌數(shù)下降較快,培養(yǎng)至3 h其活菌數(shù)對(duì)數(shù)值降為零。在pH為2.5和3.5的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),活化后的菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)消除了酸脅迫帶來(lái)的不利影響,一定程度上保持了菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定性[22],1 h后其存活率分別達(dá)到了100.70%和103.89%,2 h后活菌數(shù)有所下降,但其活菌數(shù)對(duì)數(shù)值均在7以上。培養(yǎng)至3 h時(shí),其存活率分別為91.20%和97.50%。說(shuō)明了植物乳桿菌KLDS 1.0318具有較好的耐酸能力。

圖3 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)酸的耐受性

2.4 耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)

由圖4可知,在膽鹽質(zhì)量濃度為0.03 g/100 mL條件下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),植物乳桿菌KLDS 1.0318活菌數(shù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),培養(yǎng)至4 h時(shí),其存活率達(dá)到了109.73%。說(shuō)明0.03%的低膽鹽濃度所產(chǎn)生的滲透壓較小,對(duì)菌體細(xì)胞活性影響不大,該菌株仍能夠保持較好的穩(wěn)定性并呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。菌株在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5 g/100 mL條件下培養(yǎng)1 h后,其活菌數(shù)均有所下降,說(shuō)明高濃度膽鹽對(duì)植物乳桿菌KLDS 1.0318的生長(zhǎng)有一定抑制作用,但作用4 h后,菌株在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5 g/100 mL的培養(yǎng)基中的存活率分別為95.40%和87.76%,活菌數(shù)對(duì)數(shù)值均在6以上。表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318具有較好的膽鹽耐受性。

圖4 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)膽鹽的耐受性

2.5 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.5.1 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值的影響 由圖5可知,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,在乳桿菌與脾淋巴細(xì)胞的比例為1∶1、10∶1及100∶1三個(gè)條件下,脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值均有不同程度的提高,且差異顯著(p<0.05),表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)體外小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用,并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖5 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值的影響

2.5.2 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)的影響 由圖6可知,當(dāng)乳桿菌與脾淋巴細(xì)胞的比例為1∶1時(shí),淋巴細(xì)胞PI值小于1,當(dāng)乳桿菌與脾淋巴細(xì)胞的比例為10∶1和100∶1時(shí),PI值均大于1,表明了在此條件下植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠促進(jìn)體外小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖,并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖6 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)的影響

2.6 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

由圖7可知,與陰性對(duì)照組相比,在乳桿菌與巨噬細(xì)胞的比例為1∶1、10∶1及100∶1三個(gè)條件下,OD540均有不同程度的增長(zhǎng),說(shuō)明在乳桿菌作用下,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力顯著增強(qiáng)(p<0.05),表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠激活巨噬細(xì)胞活性,增強(qiáng)其吞噬功能。

圖7 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

2.7 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平的影響

由圖8可知,相比于陰性對(duì)照組,在乳桿菌與巨噬細(xì)胞的比例為1∶1、10∶1及100∶1三個(gè)條件下,OD450均有所增加,說(shuō)明巨噬細(xì)胞在乳桿菌作用下,其能量代謝水平顯著提高(p<0.05),表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性,提高其能量代謝水平。

圖8 植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平的影響

3 討論與結(jié)論

乳酸菌是人和動(dòng)物腸道中重要的生理菌群之一,具有促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、提高機(jī)體免疫力、降膽固醇、抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等多種益生功能[23-26]。而乳酸菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提是其可在人體腸道中存活并定殖。

乳酸菌能夠快速生長(zhǎng)以及發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)酸不僅是表明其活力良好的特征之一,還能夠提高其發(fā)酵產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性[27-28]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了植物乳桿菌KLDS 1.0318的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力,結(jié)果表明該菌株生長(zhǎng)迅速的同時(shí)具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力,可初步作為具有潛在發(fā)酵性能的菌株。

pH是影響乳酸菌生長(zhǎng)的重要因素之一,人體胃液里含有胃酸,其pH高低因個(gè)人飲食狀況存在較大波動(dòng),空腹時(shí)pH為2.5左右,進(jìn)食后胃液被稀釋,其pH上升至3.5[29]。人體消化過(guò)程約需要4 h,而食物通過(guò)胃的時(shí)間一般為1～2 h[30],因此乳酸菌必須具有較強(qiáng)的耐酸能力才能順利通過(guò)胃酸屏障而到達(dá)腸道中發(fā)揮其益生功能。Bezkorovainy等[31]通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn),6株乳桿菌在pH1.5～3.0條件下的存活時(shí)間在3 h左右。本實(shí)驗(yàn)研究了植物乳桿菌KLDS 1.0318在3種不同酸度條件下短時(shí)間內(nèi)的存活狀況,結(jié)果顯示,其在pH為2.5、3.5條件下培養(yǎng)至3 h后其存活率分別為95.40%和87.76%,表明植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)酸具有較強(qiáng)的耐受能力。

食物中的乳酸菌經(jīng)過(guò)胃的消化后進(jìn)入小腸將會(huì)面臨高濃度的膽鹽環(huán)境,高濃度膽鹽會(huì)破壞細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu),導(dǎo)致膜蛋白解離,使細(xì)胞內(nèi)容物滲漏而造成細(xì)胞死亡[32]。因此,除了耐酸能力,乳酸菌能否適應(yīng)人體小腸中的膽鹽脅迫是其發(fā)揮益生功效的重要前提。人體小腸中的膽鹽質(zhì)量濃度在0.03～0.3 g/100 mL之間[33],食物在小腸中一般停留1～4 h[34],因此本實(shí)驗(yàn)研究了植物乳桿菌KLDS 1.0318在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.03、0.3和0.5 g/100 mL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～4 h后,測(cè)定其活菌數(shù)的變化情況。結(jié)果顯示,該菌株在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5 g/100 mL條件下的存活率分別達(dá)到95.40%和87.76%,表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318具有較好的膽鹽耐受性。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力,具有在人體胃腸道中定殖的潛力。在此基礎(chǔ)上,本研究測(cè)定了該菌株對(duì)小鼠體外免疫細(xì)胞活性的影響,評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)功能。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,脾臟中的淋巴細(xì)胞是機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞[19],淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值和增殖指數(shù)的大小可以直接反映其活力的高低,是反映T淋巴細(xì)胞免疫活力的關(guān)鍵指標(biāo)之一[35]。孟祥晨等[36]通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS 1.0391和植物乳桿菌KLDS 1.0706均對(duì)小鼠脾細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)乳桿菌與脾淋巴細(xì)胞的比例為1∶1、10∶1及100∶1時(shí),相比于陽(yáng)性對(duì)照組,脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值均顯著提高(p<0.05)。當(dāng)乳桿菌與脾淋巴細(xì)胞的比例為10∶1和100∶1時(shí),植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠顯著提高脾細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI值>1)。巨噬細(xì)胞也是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,具有強(qiáng)大的吞噬抗原顆粒的作用,還可作為抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),調(diào)節(jié)和提高免疫應(yīng)答。劉東方[37]通過(guò)體外研究表明,鼠李糖乳桿菌LV108和短雙歧桿菌XJH301可以顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖,提高巨噬細(xì)胞吞噬活力。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,在乳桿菌與巨噬細(xì)胞的比例為1∶1、10∶1及100∶1三個(gè)條件下,相比于陰性對(duì)照組,植物乳桿菌KLDS 1.0318均能夠顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬能力及其能量代謝水平。

綜上所述,植物乳桿菌KLDS 1.0318生長(zhǎng)較快,具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸、耐酸及耐膽鹽能力,能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫活性,可以作為具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用的益生乳桿菌。