李明智,童 微,胡婕倫,殷軍藝,聶少平,黃曉君

(南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是我國(guó)名貴中草藥[1],系蘭科石斛屬植物[2],具有很高的藥用價(jià)值[3]。鐵皮石斛為《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版收載的正品石斛之一[4],具有益胃生津、滋陰清熱功效,可用于陰傷津虧,口干煩躁,食少干嘔,病后虛熱以及目暗不明等[5-6]。由于中藥鐵皮石斛功效確切,2015年版《中國(guó)藥典》將其作為新增品種單獨(dú)列出,與中藥石斛進(jìn)行區(qū)分[3]。鐵皮石斛化學(xué)成分多樣,主要有生物堿、多糖、菲類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、香豆素類(lèi)、花青素等化合物[7-9]。其中,多糖在鐵皮石斛中的含量較高(含量大于25%)[10-13],且具有抗腫瘤[14-15]、增強(qiáng)免疫力[16-20]、降血糖[21]等多種功效。近年來(lái),石斛多糖的研究逐漸引起人們的重視,其中免疫調(diào)節(jié)活性備受關(guān)注[16,19-20],且多糖的生物活性與其相對(duì)分子質(zhì)量的大小有關(guān)[22-25]。國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵皮石斛多糖及修飾后的鐵皮石斛多糖能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫及體液免疫的報(bào)道較多[18-20,26],Huang[16]等報(bào)道鐵皮石斛多糖可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和分化,提高血清中免疫球蛋白含量,刺激腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。童微[10]等報(bào)道硫酸化和脫乙?；揎椦苌锬軌蛟鰪?qiáng)鐵皮石斛多糖對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的免疫活性,而羧甲基化修飾則表現(xiàn)為顯著的抑制作用。目前對(duì)于鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分與其體外免疫活性關(guān)系的報(bào)道還缺乏全面性[10,18,27-29],但Cai[26]等報(bào)道鐵皮石斛水提物、粗多糖及純多糖均可增強(qiáng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的吞噬活性及NO、細(xì)胞因子的分泌并增強(qiáng)其相關(guān)mRNA及蛋白的表達(dá),Xia[20]等報(bào)道其分離的兩個(gè)組分533.7 kDa DOP-1和159.5 kDa DOP-2在體內(nèi)均能顯著增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌,提升NK細(xì)胞毒性,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性及其細(xì)胞因子的分泌。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同分子量的鐵皮石斛多糖分級(jí)組分與其體外免疫活性的關(guān)系,以期完善鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分與其體外免疫活性存在的關(guān)系,為鐵皮石斛多糖在天然保健產(chǎn)品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛干莖 由云南金九地生物科技有限公司提供;小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心;脂多糖(LPS)、透析袋(截留分子量3500 Da)、巖藻糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;CCK-8試劑盒(CCK8) 日本同仁公司;NO檢測(cè)試劑盒 南京建成生物有限公司;TNF-α、IL-1β試劑盒 武漢博士德公司;耐高溫α-淀粉酶(40000 U/g) 杰能科(中國(guó))生物工程有限公司;咔唑 上海國(guó)藥集團(tuán);牛血清白蛋白標(biāo)品 美國(guó) AMRESCO 公司;考馬斯亮蘭G-250 Bio-Rad公司;氯磺酸、一氯乙酸 薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;濃硫酸、無(wú)水碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、吡啶、苯酚、正己烷、95%乙醇、NaN3、苯酚、甲醇、甲酰胺、無(wú)水乙醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent 1260 HPLC系統(tǒng) 美國(guó)Agilent Technologys公司;TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司;Dionex ICS-5000離子交換色譜系統(tǒng) 美國(guó)Dionex公司;HPSEC-MALLS色譜系統(tǒng) 美國(guó)Wyatt Technology公司;高效分子排阻色譜系統(tǒng) 美國(guó)Brookhaven公司;TGL-16GA CO2培養(yǎng)箱、Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;HGC-24A醫(yī)用超凈工作臺(tái) 吳江市凈化設(shè)備總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛純多糖的制備 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果[12],現(xiàn)將純多糖制備流程簡(jiǎn)化如下:鐵皮石斛干莖→粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩→正己烷、95%乙醇溶液分別浸泡24 h→濾渣→70 ℃熱水浸提4 h→10000×g離心20 min→上清液真空濃縮至原有體積的1/6→80%乙醇醇沉過(guò)夜→10000×g離心20 min→沉淀去離子水復(fù)溶→冷凍干燥→鐵皮石斛粗多糖(DOC)→溶解→70 ℃α-淀粉酶酶解2 h→-80 ℃凍融4次→12000×g離心40 min→3500 Da透析袋透析72 h→80%乙醇醇沉過(guò)夜→10000×g離心20 min→去離子水復(fù)溶→冷凍干燥→鐵皮石斛純多糖(DOP)。

1.2.2 鐵皮石斛純多糖分級(jí)組分的制備及分析

1.2.2.1 鐵皮石斛純多糖的分級(jí) 10 g DOP溶解于1 L的去離子水中形成濃度為1%(w/v,g/mL)的多糖溶液,然后向溶液中緩慢滴加無(wú)水乙醇,并不斷攪拌使溶液中乙醇濃度為30%(v/v,mL/mL),靜置過(guò)夜,離心20 min(4 ℃、10000×g),沉淀復(fù)溶凍干得F30組分。然后向收集的上清液中緩慢滴加無(wú)水乙醇,直至混合溶液中乙醇濃度達(dá)到40%(v/v,mL/mL),靜置過(guò)夜,離心20 min(4 ℃、10000×g),沉淀復(fù)溶凍干得F40組分。將得到的上清液再次進(jìn)行醇沉使乙醇濃度達(dá)到50%,沉淀復(fù)溶凍干得F50組分,然后將收集得到的上清液在60 ℃下旋蒸并凍干得到F50S組分。

1.2.2.2 鐵皮石斛多糖不同級(jí)分化學(xué)成分分析 以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[30];以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸-咔唑法測(cè)定糖醛酸含量[31];以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[32]。

1.2.2.3 鐵皮石斛多糖不同級(jí)分的單糖組成分析 分別稱(chēng)取5 mg多糖樣品,加入0.5 mL 12 mol/L H2SO4溶液,冰水浴攪拌30 min,然后加水稀釋至2 mol/L,100 ℃下油浴攪拌水解 2 h,定容至50 mL,混勻后吸取1 mL定容至10 mL。單糖標(biāo)品為鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(Glca)和半乳糖醛酸(Gala),配制成不同濃度的混標(biāo),采用相同的色譜條件測(cè)定,過(guò)0.22 μm濾膜后經(jīng)Dionex ICS-5000系統(tǒng)檢測(cè)。

檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器;色譜條件:CarboPac PA20G保護(hù)柱(3 mm×30 mm)和CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm)串聯(lián);流動(dòng)相A為0.25 mol/L NaOH溶液,流動(dòng)相B為超純水,流動(dòng)相C為1 mol/L CH3COONa,淋洗液梯度洗脫條件見(jiàn)表1;流速為0.5 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)器溫度為35 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

表1 離子交換色譜洗脫條件

1.2.2.4 鐵皮石斛純多糖及分級(jí)組分分子量分析 采用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光光散射(HPSEC-MALLS)色譜系統(tǒng)分析鐵皮石斛純多糖及各分級(jí)組分分子量、粘度等參數(shù)。

色譜條件:色譜柱:SB-804 HQ(Shodex OHpak,8.0 mm ID×300 mmL)和SB-806 HQ(Shodex OHpak,8.0 mm ID×300 mmL)串聯(lián)。色譜柱和檢測(cè)器溫度均為35 ℃,流動(dòng)相為含有0.02%的NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液,流速0.6 mL/min,樣品濃度1 mg/mL,進(jìn)樣量100 μL,ASTRA 6.1軟件采集并分析數(shù)據(jù)。

1.2.2.5 鐵皮石斛純多糖分級(jí)組分的均一性檢測(cè) 采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對(duì)鐵皮石斛多糖分級(jí)組分的均一性進(jìn)行檢測(cè)。利用Agilent 1260 HPLC進(jìn)行分析,色譜條件:流動(dòng)相為0.02% NaN3溶液,流速0.6 mL/min;色譜柱UltrahydrogelTM Linear Column(300 mm×7.8 mm),RI 2410示差檢測(cè)器均一性檢測(cè);檢測(cè)器溫度和柱溫均為35 ℃,樣品濃度為1 mg/mL,進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.3 鐵皮石斛純多糖分級(jí)組分的體外免疫活性研究

1.2.3.1 CCK-8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的活力 將RAW264.7細(xì)胞個(gè)數(shù)調(diào)整為4×104個(gè)/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(0.1 mL/孔),將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,再分別加入終濃度均為40 μg/mL的F30、F40、F50和F50S樣品?？瞻讓?duì)照組,含有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液;陰性對(duì)照組,含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞;以及LPS陽(yáng)性對(duì)照組,混合溶液中LPS濃度為1 μg/mL。實(shí)驗(yàn)中各多糖組及對(duì)照組均設(shè)置10個(gè)復(fù)孔,在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后加入10 μL的CCK-8試劑,1.5 h后終止培養(yǎng),測(cè)定450 nm處OD值。細(xì)胞活力按公式(1)進(jìn)行計(jì)算:

式(1)

式中,A1:含有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液孔的吸光度值;A0:陰性對(duì)照孔的吸光度值;A2:空白對(duì)照孔的吸光度值。

1.2.3.2 RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的測(cè)定 將RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,給藥方式同1.2.3.1,同時(shí)設(shè)置LPS陽(yáng)性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,參照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NO含量。

1.2.3.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β將RAW264.7細(xì)胞個(gè)數(shù)調(diào)整為5×106個(gè)/mL,分別加入0.1 mL懸浮液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,給藥方式同1.2.3.1,同時(shí)設(shè)置1 μg/mL的LPS陽(yáng)性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔,然后加入培養(yǎng)基至總體積為0.2 mL,培養(yǎng)24 h后1000 r/min條件下離心5 min收集上清。應(yīng)用ELISA試劑盒測(cè)定RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子的量,具體操作按照ELISA試劑盒步驟。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分化學(xué)成分分析

鐵皮石斛純多糖DOP及各分級(jí)組分的化學(xué)成分分析結(jié)果如表2所示。

表2 鐵皮石斛純多糖及分級(jí)組分化學(xué)成分分析

從表2中可知,各組分中性糖含量與DOP相比都具有顯著性差異(p<0.05),其中F40和F50組分中含量較高,而F50S組分中含量較低,表明各分級(jí)組分并不完全是由中性糖構(gòu)成;各組分糖醛酸含量較DOP均有所降低。各組分蛋白質(zhì)含量與DOP相比都具有顯著性差異(p<0.05),其中F40組分中蛋白質(zhì)含量極低,在本方法中未檢測(cè)到。

2.2 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分分子量及單糖組成分析

鐵皮石斛純多糖DOP及其分級(jí)組分的分子量及單糖組成分析結(jié)果如表3所示。從表3中可知,隨乙醇濃度的增加,分級(jí)組分的重均分子量、數(shù)均分子量和固有粘度均逐漸降低,而Mw/Mn則逐漸增加。Mw/Mn稱(chēng)為高聚物的分子量分散指數(shù),其數(shù)值表征了高聚物分子量的分部寬度。其值越大,則表明分子鏈分布越寬,多分散性越高。由單糖組成結(jié)果可知,DOP及各分級(jí)組分均主要由甘露糖和葡萄糖組成,但在比例上存在差異,表明各組分均主要為葡甘露聚糖,其中F50S組分中還含有少量的半乳糖。從表3中可知,F30、F40、F50和F50S各組分中Man與Glc的摩爾比例逐漸增加,其可能的原因是醇沉?xí)r先沉淀出大分子,而這些大分子主要是DOP的主鏈結(jié)構(gòu),后沉淀出支鏈結(jié)構(gòu),而支鏈結(jié)構(gòu)中連接有半乳糖醛酸,所以Man與Glc的摩爾比例逐漸增加。

表3 DOP、F30、F40、F50 和F50S的分子量及單糖組成

2.3 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分的均一性檢測(cè)

鐵皮石斛純多糖DOP及其分級(jí)組分的HPGPC圖譜如圖1所示。

圖1 DOP、F30、F40、F50及F50S的HPGPC圖譜

從圖1中可知,DOP及F30、F40、F50和F50S均只含一個(gè)主要的色譜峰,峰型對(duì)稱(chēng)且較窄,表明DOP及各分級(jí)組分均一性較好。與其他組分相比較,F50S的峰最寬,表明其多分散性最高。這與分子量分析結(jié)果相符合。

2.4 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

如圖2所示,與空白對(duì)照組相比,DOP、F30、F40、F50和F50S組均能顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)(p<0.05)。與DOP組相比,F50S組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力影響較強(qiáng)(p<0.05),而F30、F40組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力影響較DOP組弱(p<0.05)。分子量被認(rèn)為是決定多糖免疫調(diào)節(jié)活性中最重要的一個(gè)參數(shù),分子量為100 kDa左右的多糖有著較好的免疫調(diào)節(jié)活性[33]。F50S組分的分子量為136.2 KDa,因此相比與其他組分其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力有較顯著的作用。

圖2 DOP、F30、F40、F50及F50S對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力影響

2.5 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響

NO是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要效應(yīng)分子,同時(shí)也是巨噬細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志。鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響如圖3所示。

圖3 DOP、F30、F40、F50及F50S對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

圖3表明,與空白對(duì)照組相比,鐵皮石斛多糖分級(jí)組分均顯著促進(jìn)了RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的釋放(p<0.05)。與DOP組相比,F30、F40、F50組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的釋放作用較DOP組弱(p<0.05),而F50S組較DOP組強(qiáng)(p<0.05),再次驗(yàn)證鐵皮石斛多糖與其分級(jí)組分能增強(qiáng)體外免疫活性,且分子量能顯著影響多糖的免疫調(diào)節(jié)活性,分子量較小的,免疫調(diào)節(jié)活性較強(qiáng)。

2.6 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β的影響

圖4、圖5表明,與正常對(duì)照組相比,鐵皮石斛純多糖及各分級(jí)組分均能顯著促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌(p<0.05)。與DOP組相比,F30、F40、F50組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的作用較DOP組弱(p<0.05),而F50S組較DOP組強(qiáng)(p<0.05);與正常對(duì)照組相比,F30、F40組的IL-1β分泌量均無(wú)顯著性變化(p>0.05),而DOP及F50、F50S組均能顯著促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌量(p<0.05)。與DOP組相比,F50S組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的作用較DOP組強(qiáng)(p<0.05)。巨噬細(xì)胞表面有著許多不同的模式識(shí)別受體,它們能識(shí)別不同的外來(lái)分子從而引起不同的免疫反應(yīng)[34]。因此鐵皮石斛多糖及各分級(jí)組分對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1β可能是通過(guò)不同而又特定的多糖受體來(lái)實(shí)現(xiàn)不同的免疫反應(yīng),因此會(huì)有差異性,但總體來(lái)說(shuō)分子量較小的,其免疫調(diào)節(jié)活性較好。

圖4 DOP、F30、F40、F50及F50S對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

圖5 DOP、F30、F40、F50及F50S對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β的影響

3 結(jié)論

鐵皮石斛純多糖及其分級(jí)組分均主要為中性糖。分子量及均一性分析表明DOP、F30、F40、F50、F50S分子量分別為262.4、314.5、248.3、202.9和136.2 kDa,且各組分均一性良好。單糖組成分析表明DOP及各分級(jí)組分均主要由甘露糖和葡萄糖組成,其甘露糖與葡萄糖的摩爾比逐漸增加。體外免疫活性研究表明DOP及各分級(jí)組分均能顯著促進(jìn)體外免疫調(diào)節(jié)活性,能使RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖作用、NO的釋放和TNF-α及IL-1β的分泌均顯著性增加,其分子量較小的,免疫調(diào)節(jié)活性較好。巨噬細(xì)胞表面有著許多不同的模式識(shí)別受體,它們能識(shí)別不同的外來(lái)分子從而引起不同免疫反應(yīng)。因此鐵皮石斛多糖及各分級(jí)組分對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)可能是通過(guò)不同而又特定的多糖受體來(lái)實(shí)現(xiàn)不同的免疫反應(yīng)。多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與其化學(xué)組成、分子量大小、構(gòu)象、糖苷鍵的連接方式、支鏈的數(shù)量有關(guān),分子量被認(rèn)為是決定多糖免疫調(diào)節(jié)活性中最重要的一個(gè)參數(shù)。因此本研究中鐵皮石斛多糖及各分級(jí)組分因其結(jié)構(gòu)的不同而使得其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)不同免疫調(diào)節(jié)活性。本研究為鐵皮石斛多糖分級(jí)組分在提高免疫力方面提供了一定理論基礎(chǔ),但是否在體內(nèi)也有相同的作用及其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制還尚未明確,有待于進(jìn)一步的深入研究。