姜圓圓,趙 巖,*,王士杰,郜玉鋼,劉雙利,楊 鶴,張連學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院,吉林吉林 132101)

唇形科薄荷屬植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.),又稱水益母,為廣泛種植的宿根性草本植物;其莖葉具有清涼的芳香氣味,沁人心脾;是一種兼具觀賞與藥用價值的經(jīng)濟作物。作為中藥,薄荷疏散風(fēng)熱,清利頭目,利咽,透疹,疏肝行氣;用于風(fēng)熱感冒,風(fēng)疹,麻疹,胸脅脹悶等癥[1]。薄荷中含有多種萜類、黃酮類、有機酸類等天然成分;此外薄荷富含揮發(fā)油——薄荷油,其主要成分為一種單萜類成分——L-薄荷醇(又稱薄荷腦),含量可達62%～87%[2];L-薄荷醇具有加強中樞抑制、清涼止癢、利膽、促滲透、消炎止痛等多種藥理作用[3]。

癲癇是一種以反復(fù)發(fā)作為特征的慢性神經(jīng)性疾病,常伴有認知缺陷和情緒障礙,在人類的全年齡段均具有較高的發(fā)病率。由于癲癇發(fā)作是大腦中不可控的神經(jīng)興奮的結(jié)果,所以癲癇一直被認為是神經(jīng)疾病。據(jù)估算,全世界有5000萬人患有癲癇,其中85%的病例集中在低收入和中低收入國家[4],大約有20%由于服用抗癲癇藥產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用,還有約30%的難治性癲癇患者無法獲得治療[5]。在對癲癇發(fā)生和發(fā)展的研究過程中,產(chǎn)生了新的治療觀點,即以有效地預(yù)防癲癇發(fā)作為主要治療目標(biāo)。癲癇持續(xù)狀態(tài)是一種急重癥,可以發(fā)生在各種類型的發(fā)作形式上,如驚厥性的癲癇持續(xù)狀態(tài)和非驚厥性的癲癇持續(xù)狀態(tài),其中驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)可能嚴(yán)重至危及生命[6]。許多抗癲癇藥即是試圖降低癲癇發(fā)作,靶向神經(jīng)元離子通道、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸受體一直是消除癲癇發(fā)作的主要關(guān)注點,常規(guī)的抗癲癇劑(苯妥英和卡馬西平)和新型的抗癲癇藥(加巴噴丁、氨己烯酸和羅雷利唑)具有嚴(yán)重的副作用[7-8]。有30%的患者對這些藥物具有耐藥性[9]。因此,新的抗驚厥藥物的發(fā)現(xiàn)以降低癲癇導(dǎo)致的癥狀顯得極為緊迫。

中醫(yī)藥治療癲癇有著幾千年的歷史,中醫(yī)理論認為驚厥屬“癇病”,病機與肝的疏泄失常密切相關(guān)[10]?！侗静菔觥酚涊d薄荷可治癲癇,去高顛,醫(yī)治小兒驚狂壯熱。薄荷油(主要含L-薄荷醇)通過吸嗅可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中γ-氨基丁酸和谷氨酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量[11]。有研究表明薄荷醇可以調(diào)節(jié)腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)中GABA受體的突觸和突觸群體,降低印防己毒素對氯離子通道的影響[12]。但截止目前,尚缺少L-薄荷醇抗癲癇的實驗數(shù)據(jù)及作用機理的相關(guān)文獻報道。因此,該文對薄荷中的有效成分L-薄荷醇的抗驚厥活性及其潛在的作用機理開展了實驗研究,以期為L-薄荷醇藥理的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-薄荷醇(純度≥99.5%)、卡馬西平(純度≥99%)、戊四唑(純度≥ 98%) 上海麥克林生化科技有限公司;N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA,純度≥98%) 美國Sigma公司;磷酸緩沖鹽PBS(pH7.2) 上?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司;小鼠γ-氨基丁酸試劑盒、小鼠谷氨酸試劑盒 南京建成生物公司;雄性ICR小鼠,體重18～22 g 由長春市億斯實驗動物科技有限公司提供,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(2016-0003),小鼠正常自由進食飲水,室溫(25±2) ℃,濕度55%±5%,維持正常晝夜節(jié)律。

JA2003J電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;Avanti TM J-3OI冷凍離心機 海南赫敏儀器有限公司;Spectra MAX 190酶標(biāo)儀 上海美谷分子儀器有限公司;DY89-1電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-薄荷醇對抗戊四唑所致小鼠驚厥實驗 將50只健康雄性小鼠隨機分為5組,每組10只,分別空白組(相同體積的生理鹽水)、陽性組卡馬西平(80 mg/kg),L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三個劑量組,連續(xù)灌胃給藥3 d,一天一次。于末次給藥60 min后,每組小鼠腹腔注射戊四唑(70 mg/kg)[13],每只小鼠單獨放置籠子里觀察30 min。以全身陣攣性驚厥為觀察指標(biāo),以給藥后至出現(xiàn)第一次陣攣發(fā)作為驚厥潛伏期,以陣攣性發(fā)作出現(xiàn)的時間為驚厥持續(xù)時間,觀察記錄30 min內(nèi)驚厥小鼠的數(shù)量、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、死亡數(shù)量,計算死亡率[14]。

1.2.2 L-薄荷醇對NMDA所致小鼠驚厥實驗 將50只健康雄性小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為空白組(相同體積的生理鹽水)、陽性組卡馬西平組(80 mg/kg)、L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(8 mg/kg)三個劑量組,連續(xù)灌胃給藥3 d,一天一次。于末次給藥30 min后,每組小鼠腹腔注射NMDA(50 mg/kg)[15],每只小鼠單獨放置籠子里觀察30 min。以全身陣攣性驚厥為觀察指標(biāo),以給藥后至出現(xiàn)第一次陣攣發(fā)作為驚厥潛伏期,以陣攣性發(fā)作出現(xiàn)的時間為驚厥持續(xù)時間,觀察記錄30 min內(nèi)驚厥小鼠的數(shù)量、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、死亡數(shù)量,計算死亡率。

1.2.3 GABA與Glu的測定 行為學(xué)實驗結(jié)束,立即將小鼠斷頭處死,在冰臺上迅速將小鼠腦組織取出,放置于-80 ℃冰箱保存,在測定前,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗腦組織表面血跡,稱重,加入9倍體積的冰冷的磷酸鹽緩沖溶液PBS(pH7.2),使用勻漿機將腦組織充分勻漿,將組織液置于離心機中4 ℃,12000 r/min離心4 min,取上清液[16]。按照試劑盒說明分別檢測上清液中GABA、Glu含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 L-薄荷醇對戊四唑所致小鼠驚厥的影響

L-薄荷醇對戊四唑所致驚厥的影響如表1所示,戊四唑可以反映藥物的抗驚厥效果,腹腔注射40～100 mg/kg可誘發(fā)驚厥[17],與空白對照組比較L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)可極顯著縮短戊四唑所致小鼠驚厥持續(xù)時間(p<0.01),使驚厥潛伏期極顯著延長(p<0.01),使死亡率降低到30%,抗驚厥效果優(yōu)于陽性藥卡馬西平。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)與空白對照組比較可顯著縮短驚厥持續(xù)時間(p<0.05),延長驚厥潛伏期(p<0.05),減少戊四唑所致驚厥數(shù),使死亡率降低到50%;但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)對戊四唑所致驚厥無抑制效果,對驚厥數(shù)量、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、死亡率均無顯著性影響。實驗結(jié)果顯示L-薄荷醇可抑制戊四唑所致驚厥,且呈一定的劑量依懶性,低劑量的L-薄荷醇對驚厥的發(fā)作無明顯的抑制作用。戊四唑是通過GABA受體介導(dǎo)引起驚厥,中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA含量變化與驚厥密不可分。有研究表明L-薄荷醇通過增強GABA能緊張性抑制下調(diào)中樞神經(jīng)元的興奮性,可以抑制大鼠電刺激所產(chǎn)生的癲癇發(fā)作[18]。L-薄荷醇可能是作用于GABA能系統(tǒng)抑制戊四唑誘導(dǎo)的驚厥。

表1 L-薄荷醇對戊四唑所致小鼠驚厥的影響(x±s,n=10)

2.2 L-薄荷醇對NMDA所致小鼠驚厥的影響

如表2所示,與空白對照組比較,L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)可極顯著縮短NMDA所致小鼠驚厥持續(xù)時間(p<0.01),使死亡率降低至20%,使驚厥潛伏期延長(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)與空白對照組比較可顯著縮短驚厥持續(xù)時間(p<0.05),延長驚厥潛伏期(p<0.05),降低死亡率至40%,但對NMDA所致驚厥數(shù)無影響。L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)對NMDA所致驚厥無抑制效果,對驚厥數(shù)量、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、死亡率均無影響。驚厥發(fā)作的機理表明[19],興奮性氨基酸谷氨酸與神經(jīng)元異常興奮密切相關(guān),NMDA是一種強力外源性致驚劑,作用于谷氨酸NMDA受體,通過阻斷NMDA谷氨酸型受體介導(dǎo)的突觸興奮可以抑制驚厥發(fā)作。腹腔注射50 mg/kg的NMDA即可誘發(fā)驚厥,L-薄荷醇高劑量組(70 mg/kg)與中劑量組(30 mg/kg)對NMDA表現(xiàn)出的抗驚厥效果可能是通過作用于谷氨酸能系統(tǒng)。

2.3 L-薄荷醇對戊四唑所致驚厥小鼠腦內(nèi)GABA含量的影響

如圖1,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白對照組比較明顯升高,具有極顯著差異(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白對照組比較具有顯著差異(p<0.05),L-薄荷醇的高劑量和中劑量組可以拮抗戊四唑所致小鼠腦內(nèi)GABA含量的降低。但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)小鼠腦組織中GABA含量與空白組比較無差異性。腦組織中GABA含量降低是神經(jīng)細胞過度興奮,過度放電,誘發(fā)驚厥的主要原因之一[20]。實驗通過對GABA含量的檢測,數(shù)據(jù)結(jié)果表明,與空白組比較,L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)與中劑量(30 mg/kg)能增加小鼠腦中GABA的含量,其差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義。證實L-薄荷醇通過作用在γ-氨基丁酸能系統(tǒng),拮抗戊四唑誘導(dǎo)驚厥發(fā)生。

圖1 L-薄荷醇各劑量組對戊四唑所致驚厥小鼠腦內(nèi)GABA含量的影響

2.4 L-薄荷醇對NMDA所致驚厥小鼠腦內(nèi)Glu含量的影響

如圖2,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白對照組比較明顯降低,具有極顯著差異(p<0.01)。L-薄荷醇中劑量組(30 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白對照組比較具有顯著差異(p<0.05),L-薄荷醇的高劑量和中劑量組可以拮抗NMDA所致小鼠腦內(nèi)Glu含量的升高。但L-薄荷醇的低劑量組(8 mg/kg)小鼠腦組織中Glu含量與空白組比較無差異性。腹腔注射NMDA可增加抑制性氨基酸谷氨酸的含量,誘發(fā)驚厥,L-薄荷醇的高劑量組(70 mg/kg),中劑量組(30 mg/kg)極顯著(p<0.01)的降低了腦組織中Glu水平,與行為學(xué)表現(xiàn)相一致,減低NMDA所致驚厥死亡率,延長驚厥潛伏期,縮短驚厥持續(xù)時間,降低驚厥發(fā)生次數(shù)。

圖2 L-薄荷醇各劑量組對NMDA所致驚厥小鼠腦內(nèi)Glu含量的影響

3 討論

戊四唑模型是常用的篩選藥物抗驚厥作用的方法,戊四唑是GABA受體拮抗劑,通過抑制GABA神經(jīng)遞質(zhì)引起驚厥[21]。GABA是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性受體[22],直接和間接地參與大多數(shù)腦疾病,包括焦慮障礙、睡眠障礙、情緒障礙、認知障礙、精神分裂癥和癲癇癥,GABA含量的降低與驚厥有著密不可分的關(guān)系[23]。L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)可扭轉(zhuǎn)由戊四唑所致GABA含量的降低,有效地抑制驚厥發(fā)生數(shù)量,縮短驚厥持續(xù)時間,減少驚厥死亡率。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì),驚厥發(fā)生多數(shù)是由于興奮和抑制作用失衡所致,當(dāng)興奮因素占明顯優(yōu)勢時可誘發(fā)癲癇[24]。NMDA是谷氨酸激動劑,系統(tǒng)的腹腔或腦室內(nèi)給藥均可誘發(fā)鼠類的運動性癲癇發(fā)作[25]。動物實驗表明,應(yīng)用NMDA拮抗劑可抑制癲癇發(fā)作,證實驚厥發(fā)作與NMDA或其受體的表達有關(guān)[26],本實驗使用NMDA致驚厥模型評估了L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)和低劑量組(8 mg/kg)抗驚厥效果,實驗結(jié)果表明L-薄荷醇高劑量(70 mg/kg)、中劑量組(30 mg/kg)可扭轉(zhuǎn)由NMDA所致Glu含量的升高,有效地抑制驚厥發(fā)生數(shù)量,縮短驚厥持續(xù)時間,減少驚厥死亡率。

4 結(jié)論

本實驗研究了L-薄荷醇的抗驚厥效果及其發(fā)揮抗驚厥作用的相關(guān)機制。采用戊四唑、NMDA致驚厥模型,評估L-薄荷醇的抗驚厥效果,結(jié)果顯示L-薄荷醇高(70 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組能對抗戊四唑和NMDA所致的驚厥,有效地抑制驚厥發(fā)生數(shù)量,縮短驚厥持續(xù)時間,延長驚厥潛伏期,降低驚厥死亡率。但低劑量組(8 mg/kg)并未顯示出抗驚厥效果,可能是L-薄荷醇抗驚厥作用存在劑量依懶性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性氨基酸與抑制性氨基酸存在動態(tài)平衡,共同調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動,驚厥的發(fā)作與其含量變化極為相關(guān)[27-28]。本文通過對驚厥小鼠腦組織中GABA與Glu含量的測定證實L-薄荷醇抗驚厥的作用機制可能與對γ-氨基丁酸系統(tǒng)能和谷氨酸系統(tǒng)能神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)相關(guān)。該研究的成果將為L-薄荷醇藥理的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。有關(guān)其成藥性、深入的作用機理將在后續(xù)實驗中開展研究。