陳巧紅，盛楠，孫靜，馮波,3，胡格

（1.北京農學院動物科學技術學院/獸醫(yī)學中醫(yī)藥北京市重點實驗室，北京 102206；2.北京動物園，北京 100044；3.中國農業(yè)大學動物醫(yī)院，北京 100193）

0 引言

微血管內皮細胞（microvascular endothelial cells，MVECs） 不僅可以完成基本的血液和組織液的代謝交換，并且可以合成和分泌多種細胞因子，發(fā)揮重要的生物學功能[1]。微血管內皮細胞呈單層覆蓋于微血管內表面，是構成血管內外物質交換的一道重要屏障，也是循環(huán)血流剪切力和血液中危險因素的主要靶細胞，因而最易并且最早受到傷害[2]。內皮細胞既是細胞因子作用的靶細胞又是細胞因子的重要來源，其分泌的細胞因子有集落刺激因子（GM-CSF、G-CSF）、炎癥介質（IL-1、1L-6、IL-8、TNF-a）、血小板生成素等[3]。MVECs是抗原呈遞細胞的一種，在一定條件下能夠顯著性地表達組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）類分子，以MHCⅡ類分子限制性方式將抗原肽呈遞給淋巴細胞，促進免疫應答的進程[4]，參與炎癥反應。近年來，內皮細胞在調節(jié)微循環(huán)、炎癥反應和免疫反應等方面的功能成為研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)，微血管內皮細胞具有功能多樣性，它不僅是構成血管組織間屏障的重要成分，而且在調節(jié)細胞免疫功能[5]，保護機體內環(huán)境的穩(wěn)定，維持正常生理和免疫功能以及介導疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸[6]等方面都發(fā)揮著重要的作用。

體外試驗發(fā)現(xiàn)，登革熱病毒、漢坦病毒、巨細胞病毒、埃博拉病毒、H5N1亞型禽流感病毒和H9N2亞型禽流感病毒等均可以感染血管內皮細胞。有研究表明，H5N1亞型禽流感病毒可以在血管內皮細胞系和人肺微血管內皮細胞（PMVECs）內復制[7]。J.R.Teijaro等[8]研究人員發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染過程中，血管內皮細胞可能是機體產(chǎn)生細胞因子的重要來源并參與感染過程。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，H5N1亞型禽流感病毒感染血管內皮細胞，激活細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（IFN），啟動固有免疫應答[9]。研究人員報道，H5N1亞型高致病性禽流感病毒能誘導人PMVECs細胞凋亡[10]。因此，研究PMVECs 在流感病毒感染狀態(tài)下的變化，對于理解血管內皮細胞在疾病發(fā)生、發(fā)展中所起到的作用非常重要。如何簡單易行地制備出高純度高質量的肺微血管內皮細胞，成為對微血管內皮細胞研究的敲門磚。經(jīng)過多次實際操作，查閱文獻，總結經(jīng)驗，對現(xiàn)有大鼠肺微血管內皮原代細胞的制備及純化過程做出了切實有效的改進，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

5－7 日齡SD大鼠，購自北京興隆實驗動物養(yǎng)殖廠。

1.2 主要儀器與器材

37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱（型號為MCO-17AC），由日本SANYO公司生產(chǎn)，倒置熒光顯微鏡（型號為IX71-A21PH），由OLYMPUS公司生產(chǎn)，普通倒置顯微鏡，高速低溫離心機（SIGMA 6-16K），細胞培養(yǎng)板（Costar公司，型號：3516）超菌工作臺（型號為DL-CF-IND），由哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

hank’s粉末，由sigma公司生產(chǎn)，貨號為：SLBT7941；胎牛血清，由Gibco公司生產(chǎn)，貨號為：10099-141；DMEM高糖培養(yǎng)基粉，由Gibco公司生產(chǎn)，貨號為：1812525；0.25%胰蛋白酶由Gibco公司生產(chǎn)，貨號為：252000-056；L-谷氨酰胺，由Sigma公司生產(chǎn)，批號：03126；小鼠抗鼠抗體，由BIO-RAD公司生產(chǎn)，批號：MCA1334G；兔抗大鼠CD31單克隆抗體由Bioss公司生產(chǎn)，批號：bs-20323R；FITC 標記的羊抗兔二抗，由Bioss公司生產(chǎn)，批號：bs-0295G-FITC；DAPI染色液，由北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)，批號：C-0033；ECGS由Millipore公司生產(chǎn)，批號：02-102。

1.4 細胞的制備

原代細胞的制備：取冰盒，裝入2/3的碎冰；6孔細胞板坐入冰盒內，其中4孔每孔加入5 mLD-Hank's液，剩余2孔每孔加入5 mLDMEM培養(yǎng)基；將5日齡大鼠幼鼠仰臥固定在泡沫板上，噴75%乙醇消毒，頸靜脈放血，取肺臟放入4孔D-Hank's中依次清洗后，剪取肺臟邊緣2～3 mm，放在濾紙上滾動去除漿膜后依次放入兩孔DMEM中；組織塊放入安瓿瓶中，加入0.5 mL血清，放入冰內，用小剪子快速盡可能地剪碎10～20 min；分裝組織塊至6孔板的4孔，在37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)20 min；加入完全培養(yǎng)基1.5 mL/孔，放入恒溫箱培養(yǎng)。

1.5 細胞的純化（當原代細胞傳至第三代時開始純化過程）

1.5.1 標準純化法

（1）配液

Buffrer1：Ca2+and Mg2+free PBS supplemented with 0.1% bovine serum albumin（BSA） ，PH 7.4.

Buffrer2：Ca2+and Mg2+free PBS with 0.1% BSA and 0.6% sodium citeate or 2mM EDTA；Note：BSA can be replaced by human serum albumin （HSA） or fetal calf serum （FCS）.

Buffrer3：RPMI 1640 with 1% fetal calf serum（FCS），1mM CaCl2 and 5mM MgCl2，pH 7.0-7.4.

純化后完全培養(yǎng)基（50 mL）：內皮細胞生長支持物ECGS：規(guī)格15 mg/瓶，使用范圍在10～100 ug/mL ，實驗室用20 ug/mL。加入7.5 mLDMEM 吹勻分裝至EP管，0.5 mL/管（有效量為1 mg）。加入0.5 mLECGS ，0.5 mL 雙抗，0.5 mL L-谷氨酰胺，10 mL 血清，加DMEM定容至50 mL。

（2）純化

以直徑15 cm大皿鋪滿3大皿，細胞數(shù)量達到28的細胞量為例，介紹加入各個試劑以及加入的量。

①在1.5 mL離心管內加入80 uL磁珠，清洗3遍。（清洗過程：Buffrer1，D-Hank's，PBS都可以，本次用的是D-Hank's。加入500 uLD-Hank’s，吹打幾次，用強吸力小磁鐵吸珠至底部，小心棄掉上清，為方便吸棄也可將磁珠吸至側面）。②加入20 uL一抗（原濃度），用小旋轉儀旋轉1 min后，放在搖床（708）上30 min；消化細胞，至細胞呈一個一個分離態(tài)，離心；清洗（B1，D-h，P 均可）細胞一次，再離心，加入700 uL Buffrer1 吹勻。③清洗磁珠2次放于磁鐵上1 min 后棄上清；加入上一步的細胞懸液并混懸，吹勻換裝至另一個新的EP管；放于4 ℃ 15 min后，置于搖床（708）10 min。④加入700 uLBuffrer2（量與細胞懸液同），防止捕捉未結合磁珠的細胞，吹勻后可分至兩管便于操作。⑤清洗細胞2次以上。將上一步的離心管放于磁鐵上從上至下慢慢（2 min）講細胞吸到底部，小心棄上清，加入700 uL Buffrer1吹打2～3次，吹勻，用同樣方法小心棄上清。⑥預熱Buffrer3（37 ℃ 10 min以上），在上一步的離心管內加入200 uL預熱好的Buffrer3；加入8 uL重組的釋放緩沖液（DNase1）。⑦室溫孵育15 min。放于搖床（708）15 min；用黃槍頭吹打5～10次并避免起泡；Buffrer3預處理一個新的EP管5 min。⑧將原離心管放在磁鐵上2 min ，吸取上清在上一步的EP管內；200 uL Buffrer3洗磁珠3次吸取上清收集于上一步的EP管內。⑨用明膠（鼠尾膠原）事先潤濕12孔板的2孔，將收集的上清轉移至潤濕的一孔內，磁珠加Buffrer3吹勻后轉移至另一孔。⑩2 h后換20%加有ECGS的完全培養(yǎng)基。

1.5.2 改進純化法

（1）配液

①20%完全培養(yǎng)基（50 mL）：0.5 mL雙抗，0.5 mL L-谷氨酰胺，10 mL血清，加DMEM定容至50 mL。②其它溶液配制不變。

（2）純化

①在1.5 mL離心管內加入80 uL磁珠，用Buffrer1清洗三遍。加入500 uL Buffrer1，吹打幾次，用磁力架將磁珠吸至底部，小心棄掉上清液，為方便吸棄也可將磁珠吸至側面）。②加入20 uL一抗（原濃度），孵育30 min。置于4 ℃，3～5 min手動搖晃一次；消化細胞，至細胞呈一個一個分離態(tài)，離心；清洗（加入Buffrer1吹勻）細胞一次，再離心；加入700 uL Buffrer1吹勻制成細胞懸液。③用Buffer1清洗磁珠2次，加入Buffer1吹勻后，放于磁力架上1 min 后棄上清；加入上一步的細胞懸液并混懸，吹勻換裝至另一個新的EP管；放于4 ℃ 30 min后，2～3 min手動搖晃一次，避免起泡。④加入700 uL Buffrer2（量與細胞懸液同），防止捕捉未結合磁珠的細胞，吹勻后可分至兩管便于操作。⑤用Buffer1清洗細胞2次以上。將上一步的離心管放于磁鐵上從上至下慢慢（2 min）講細胞吸到底部，小心棄上清，加入700 uL Buffrer1用黃槍頭吹打2～3次，避免產(chǎn)生氣泡，用同樣方法小心棄上清。⑥預熱Buffrer3（37 ℃10 min以上），⑦離心管內加入200 uL預熱好的Buffrer3；加入8 uL重組的釋放緩沖液（DNase1）。⑧4 ℃孵育15 min。2～3 min手動搖晃一次避免起泡；Buffrer3預處理一個新的EP管5min。⑨將原離心管放在磁鐵上2 min ，吸取上清在Buffrer3預處理過的一個新的EP管；200 uL Buffrer3洗磁珠3次吸取上清收集于上一步的EP管內。⑩用明膠（鼠尾膠原）事先潤濕12孔板的2孔，將收集的上清轉移至潤濕的一孔內，磁珠加Buffrer3吹勻后轉移至另一孔。k加入500 uL20%不加ECGS的完全培養(yǎng)基。12 h后觀察細胞狀態(tài)。

2 改進之處

2.1 原代細胞制備

第一，原代細胞制備過程中，在取肺臟時應先找到心臟，用鑷子夾住心肺連接的位置將心臟和肺臟同時取出，再分離出肺臟。第二，分裝組織塊時，可用血清將過多的組織塊吹下，繼續(xù)鋪板。第三，組織塊貼壁60 h棄組織塊改為50 h棄組織塊。

2.2 細胞純化

第一，原代細胞傳至第三代即開始純化。第二，抗體孵育改室溫為4 ℃。第三，改搖床不間斷搖晃為3～5 min手動搖晃一次。第四，孵抗體后吹打過程均使用黃槍頭，并盡量避免泡產(chǎn)生。第五，重復進行Buffrer3洗磁珠的過程使細胞與磁珠分離更加徹底。第六，改純化后2 h加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基，純化后立即加入不含ECGS的20%完全培養(yǎng)基。

3 結果

通過多次嘗試與改進，對現(xiàn)有已發(fā)表文獻所用的方法進行實踐與改進，之后得到了狀態(tài)良好，可以穩(wěn)定傳代的大鼠肺微血管內皮細胞，具體結果見圖片。

3.1 原代細胞制備圖片

圖1 原代細胞制備圖片

（1）組織塊貼壁24 h，見A組圖片，A1為4倍鏡下圖片，A2為10倍鏡下圖片，A3為20倍鏡下圖片?？梢詮膱D片中看到內皮細胞已經(jīng)開始貼壁爬出，在組織塊邊緣可見明顯的肺微血管內皮細胞爬出，并且呈鋪路石樣生長，形態(tài)，大小均勻。

（2）組織塊貼壁50 h，如B組圖片，為棄掉組織塊之前的圖片，其中B1為4倍鏡下圖片，B2、B3為10倍鏡下圖片。此時我們可以從圖片中看出，在組織塊邊緣，較24 h時爬出了較多的內皮細胞，成片生長，相鄰組織塊旁爬出細胞基本鋪滿細胞板，呈鋪路石樣生長，形態(tài)，大小均勻。

（3）如C組圖片，為棄掉組織塊后的圖片，C1、C2為4倍鏡下圖片，C3為10倍鏡下圖片。加入1%雙抗的hank’s液用移液器輕輕吹凈組織塊，要盡可能的沖洗干凈，防止殘余組織塊繼續(xù)爬出成纖維細胞，如圖所示在原有組織塊的位置出現(xiàn)明顯的空隙。

（4）圖D，是去組織塊36 h后，可以看出細胞長勢良好已經(jīng)長滿棄掉組織塊以后出現(xiàn)的空白區(qū)域，可進行傳代培養(yǎng)。

3.2 純化后細胞圖片

純化后將解離后的上清和磁珠分別種于48孔板的2孔。

圖2 純化后細胞圖片

如圖E1是磁珠接種于細胞板內的圖片，E2為純化后目標細胞圖片，從圖片可見由6孔板4板細胞純化僅僅得到101單位數(shù)目的內皮細胞，純化結束直接加入20%完全培養(yǎng)基，24 h后換液，96 h可見E3圖片，細胞基本鋪滿48孔板，長勢良好，未見明顯的細胞形態(tài)變化。E4為第三次傳代后80 h圖片，細胞鋪排均勻，細胞狀態(tài)良好，無抽絲和形態(tài)上的異常變化；E5為免疫熒光鑒定大鼠肺內皮細胞的結果，可見視野范圍內未見雜細胞；E6為傳至第11代的照片，未見形態(tài)變化。

4 結束語

本實驗通過以上提到的幾個方面對實驗方法進行改進，獲得了純度更高的PMVECs，接下來介紹其主要理論依據(jù)和實驗進展過程。

4.1 原代細胞的制備

當前，RPMVECs的培養(yǎng)方法主要有2種，主要有酶消化法和組織塊法[11]。酶消化法操作過程復雜、試劑昂貴，細胞因活性較低難以用于后續(xù)實驗，在國內很少應用。組織塊法由于操作簡單，過程中無酶對細胞的損傷故活性較高，但該法由于特異性較低，容易受到成纖維細胞等其它雜細胞的混雜污染[12]。

（1）原代細胞制備過程中，在取肺臟時應先找到心臟，用鑷子夾住心肺連接的位置將心臟和肺臟同時取出，這樣就能得到完整的肺臟，這樣大大降低了取肺邊緣的難度，也使得肺臟的利用效率大大提高，使得原代細胞的制備變得更加高效[13]。

（2）分裝組織塊時，可用血清將過多的組織塊吹下繼續(xù)貼壁。原因有二，一方面防止因組織塊密度過大，不利于細胞的爬出；另一方面增加了鋪板量，提升了組織塊的利用率和細胞制備的效率；

（3）組織塊貼壁60 h棄組織塊改為50 h棄組織塊，此舉目的是為了減少雜細胞成纖維細胞（Fibroblasts）的數(shù)量，保證目標細胞大鼠肺微血管內皮細胞（PMVECs）的數(shù)量。文獻記載和經(jīng)驗所得，我們知道微血管內皮細胞24 h時開始爬出，成纖維細胞在60 h時已經(jīng)有部分爬出。因此，50 h棄組織塊減少了成纖維細胞數(shù)量；同時，保證了內皮細胞充足的生長時間，細胞數(shù)量得到了保證，在傳代后足夠的細胞濃度可以保證細胞良好的生長發(fā)育[14]。

4.2 細胞純化

目前已有的PMVECs的純化方法主要有生物特性選擇法、物理剖除法、局部消化法、差速黏附法及免疫磁珠法[15]。本實驗采用免疫磁珠純化法純化PMVECs[16]，具有分離速度快、效率高、重復性強、操作簡單并且不影響被分離細胞的生物學性狀和功能等優(yōu)點[17]。在純化過程中利用磁珠分選純化系統(tǒng)篩選CD31+細胞，磁珠釋放液去除CD31+細胞結合的磁珠，獲得了高純度的大鼠肺微血管內皮細胞[18]。

（1）原代細胞傳至第三代即開始純化。這樣保證了純化所需的細胞數(shù)量，也保證了CD31的高表達。免疫磁珠純化法的基本原理是磁珠通過抗體與內皮細胞特意表達蛋白CD31的結合來完成的，研究表明，內皮細胞在前三代高表達CD31，使得純化的結果更加準確可靠，在純化時有較大的細胞基數(shù)，可以提高細胞純化的成功幾率。

（2）抗體孵育改室溫為4 ℃。多次實驗后，發(fā)現(xiàn)純化結果不理想，細胞數(shù)量較少，導致最終實驗失敗后，查閱了大量文獻并且閱讀抗體說明書，發(fā)現(xiàn)抗體在4 ℃時有最高效價，于是改進實驗方法，在孵育抗體時以及后面相關操作時均在4 ℃冰箱中進行。

（3）改搖床不間斷搖晃為3～5 min手動搖晃一次?？捎行П苊馀菽a(chǎn)生，使抗體、試劑充分與磁珠、細胞接觸。搖床搖晃EP管時發(fā)現(xiàn)有大量泡沫產(chǎn)生，影響了細胞、抗體、磁珠的充分接觸，使得純化效率降低；另外手動搖晃可以將純化所用的EP管置于4 ℃冰箱中，確保了抗體的最高效價，提升了純化效率。

（4）孵抗體后吹打過程均使用黃槍頭，并盡量避免氣泡產(chǎn)生。使用黃槍頭（200 μL）吹打液體，較白槍頭（10μL）吹打徹底，較藍槍頭（1 000 mL）吹打輕緩，不會因為劇烈吹打導致泡沫的產(chǎn)生，影響細胞、抗體、磁珠及解離液等各物質的接觸[17]。

（5）重復進行Buffrer3洗磁珠的過程使細胞與磁珠分離更加徹底。在加入解離液DNasa后，磁珠與細胞分離，為了盡可能將細胞與磁珠分離，可以多次加入Buffrer3進行吹打后置于磁力架上吸取上清。

（6）改純化后2 h加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基，為純化后立即加入不含ECGS的20%完全培養(yǎng)基。在純化過程中發(fā)現(xiàn)，將上清接種于細胞板2 h細胞并沒有貼壁，此時吸取上清容易將目標細胞從板中吸出。并且加入培養(yǎng)基中加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基后，內皮細胞的形態(tài)發(fā)生了很大的變化。因此決定不適用ECGS，并且在純化結束時立即加入500 μL/孔20%完全培養(yǎng)基24 h后換液，觀察細胞貼壁良好，狀態(tài)良好。

從實驗結果來看，細胞在多次傳代后，細胞狀態(tài)良好，仍未見形態(tài)結構上的明顯變化，免疫熒光鑒定法結果表現(xiàn)可見范圍內未見雜細胞，這表明了改進方法確實提高了細胞制備純化的效率，也提高了純化后細胞的質量。