賈洪偉 李丹 王冰梅 徐廣宇 張德花 苑廣信

【摘要】目的：對(duì)蛹蟲草多肽提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究；方法：以蛹蟲草子實(shí)體提取多肽為對(duì)象，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)星點(diǎn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；結(jié)果：優(yōu)化蛹蟲草多肽提取工藝為提取最佳時(shí)間為5.39小時(shí)，加酶量1.65%，底物濃度9.3%，蛹蟲草多肽提取的OD值為0.85g/L；結(jié)論：經(jīng)實(shí)驗(yàn)得證，通過星點(diǎn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行蛹蟲草多肽提取工藝條件優(yōu)化，結(jié)果合理有效，優(yōu)化效果良好。

【關(guān)鍵詞】蛹蟲草；響應(yīng)面；工藝優(yōu)化

響應(yīng)面面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)則能夠?qū)Χ嘁蛩囟嗨胶Y選最優(yōu)條件，獲得理想的結(jié)果，是目前優(yōu)化工藝中常用的優(yōu)化方法[3]。本文通過設(shè)計(jì)星點(diǎn)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以蛹蟲草為對(duì)象，對(duì)多肽提取方法條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蟲草子實(shí)體（沈陽(yáng)妮子北冬蟲夏草種植基地）。

1.2 試劑

胃蛋白酶（活力：30003500u·mg-1）、胰蛋白酶（活力：250u·mg-1），均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，石油醚（30～60℃），茚三酮。

1.3 北冬蟲夏草多肽的提取工藝

脫脂：將北冬蟲夏草子實(shí)體粉碎，取定量粉末，按1：3（w：v）比例加入石油醚，在55℃恒溫下振蕩3h，過濾，將濾渣烘干獲得脫脂粉。

酶解過程：取3g北冬蟲夏草脫脂粉，按底物濃度不同加入一定量蒸餾水，常溫靜置30min。用NaOH溶液或HC1溶液調(diào)節(jié)至酶的最佳pH水平，按加酶量不同加入定量蛋白酶，將樣品置恒溫振蕩器中進(jìn)行水解。水解結(jié)束后，樣品煮沸10min，使酶失活，冷卻，4500r·min-1離心10min，取上清液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

THZ-C恒溫振蕩器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易有限公司）54308低溫高速離心機(jī)（美國(guó)eppendorf公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)

本研究根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert.8.06軟件，對(duì)蛹蟲草多肽提取工藝：時(shí)間（因素A）、加酶量（因素B）、底物濃度（因素C）進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。本試驗(yàn)采用三因素三水平對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，求得回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 Elisa響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。由表2可以看出：模型的P<0.0001，表明模型高度顯著，并能解釋97.86%的響應(yīng)值變化（調(diào)整確定系數(shù)R2=97.86）。通過上述所得數(shù)據(jù)，表明該模型具有良好的擬合度及較小的實(shí)驗(yàn)誤差。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表2）可知，因素A和因素B對(duì)蛹蟲草多肽提取影響顯著，而因素C對(duì)蛹蟲草多肽提取影響不顯著；因素A^2和C^2對(duì)蛹蟲草多肽提取影響其曲面效應(yīng)顯著，而B^2對(duì)蛹蟲草多肽提取影響曲面效應(yīng)不顯著；因素AC和BC對(duì)蛹蟲草多肽提取影響很顯著，因素AB對(duì)蛹蟲草多肽提取影響效應(yīng)比較顯著。

我們又對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖1至圖30從圖1至圖3中可以直接看出其中兩兩影響條件的交互作用是否互相影響，圓形（圖1）表示兩兩影響條件互相作用不顯著，而橢圓形（圖2圖3）則表示兩兩影響條件互相作用顯著。

從圖1中可以看出，在底物濃度為9.3%時(shí)，提取時(shí)間與加酶量的交互影響不顯著。圖2顯示了在加酶量為最佳（1.65%）時(shí)，提取時(shí)間與底物濃度對(duì)蛹蟲草多肽提取影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀的看出此兩因素的交互作用比較顯著。由圖2可知，提取時(shí)間與底物濃度都很高時(shí)，蛹蟲草多膚提取效率高，都低時(shí)蛹蟲草多肽提取效率低。由此可知，在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，適當(dāng)調(diào)整提取時(shí)間與底物濃度。圖3顯示了在提取時(shí)間（5.39小時(shí)）時(shí)，加酶量與底物濃度對(duì)蛹蟲草多肽提取的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀看出此兩因素的交互作用顯著，加酶量與底物濃度存在交互作用。由等高線圖和響應(yīng)面圖可知，回歸模型存在最大值，即在提取最佳時(shí)間為5.39小時(shí)，加酶量1.65%，底物濃度9.3%條件下，蛹蟲草多肽提取的OD值最大值為0.87。

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在優(yōu)化后的蛹蟲草多肽提取工藝下進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，所得蛹蟲草多肽提取量的OD值分別為0.86、0.84、0.84、0.85、0.85，平均值為0.85。通過軟件所得的預(yù)測(cè)值為0.87與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值0.85非常接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草多肽提取工藝可行。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用Box-Behnken統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)蛹蟲草多肽提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅科學(xué)合理，而且快速有效。

（通訊作者：苑廣信）

參考文獻(xiàn)

[1]鄭壯麗，黃春花，梅彩英等.蛹蟲草國(guó)內(nèi)外研究的新進(jìn)展[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2011，33（02）：225-233.