史娜艷劉芳潔張思雨柴阿麗*李寶聚*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

番茄潰瘍?。╞acterial canker of tomato）是一種世界公認(rèn)的毀滅性病害，在番茄全生育期均可發(fā)病。據(jù)報(bào)道，我國(guó)北京、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆、河北、山西、山東和上海等地均有不同程度的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致番茄植株成片或成棚萎焉死亡，損失慘重（羅來鑫 等，2005）。

番茄幼苗到成株期均可感染細(xì)菌性潰瘍病，幼苗發(fā)病初期，真葉從下向上萎蔫壞死，橫剖病莖可見維管束變褐，最后導(dǎo)致幼苗枯死。成株期染病時(shí)，可以危害葉、莖、果實(shí)等器官，葉片常從下部至上部開始顯癥，初發(fā)病時(shí)下部葉緣褪綠變褐并向上卷曲，隨病情發(fā)展，葉柄或主莖上產(chǎn)生灰白色至灰褐色條狀枯斑，莖部開裂并壞死，剖莖可見髓部中空，維管束褐變，病害擴(kuò)展緩慢時(shí)，病莖略變粗，其表面生出較多不定根或刺狀突起，造成全株枯死，幼果染病表現(xiàn)為滯育、皺縮、畸形等（楊田堂，2004；張國(guó)麗 等，2012）。

隨著番茄種植面積的不斷增加，潰瘍病發(fā)生越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致番茄產(chǎn)量與品質(zhì)降低。目前該病害主要以化學(xué)藥劑防治為主，但化學(xué)藥劑的過量使用會(huì)使防治對(duì)象產(chǎn)生抗藥性，破壞土壤微生物區(qū)系，造成農(nóng)藥殘留和超標(biāo)問題。而隨著人們對(duì)食品安全意識(shí)的提高，微生物菌劑已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展方向。

穩(wěn)定的致病性測(cè)定是進(jìn)行藥劑控制技術(shù)研究的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)通過剪頂法、莖上針刺法、浸根法、拌土法4種不同的接種方法，系統(tǒng)探討和評(píng)價(jià)不同接種方法對(duì)番茄潰瘍病發(fā)病的影響，篩選出適宜的番茄潰瘍病室內(nèi)接種方法，而后選用23種微生物菌劑進(jìn)行室內(nèi)盆栽藥效試驗(yàn)，篩選出對(duì)番茄潰瘍病有效的微生物菌劑，為番茄潰瘍病的田間防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年10月至2018年1月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。

供試菌株：番茄潰瘍病菌密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）具有強(qiáng)致病性菌株，編號(hào)FQ170806100302，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜病害綜合防治課題組。

供試培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

供試番茄品種：中蔬9號(hào)，種子購(gòu)自北京中蔬種業(yè)科技有限公司。

供試藥劑：23種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）微生物菌劑，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所篩選得到的23株B. subtilis菌株發(fā)酵制備而成，有效成分為含活芽孢200億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。60%溴硝醇可濕性粉劑購(gòu)自遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠，3%中生菌素可濕性粉劑購(gòu)自山東億嘉農(nóng)化有限公司，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑購(gòu)自陜西美邦農(nóng)藥有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種體制備 將保存的番茄潰瘍病菌株從-80 ℃冰箱取出，使用已滅菌的接種環(huán)挑取單菌落，于NA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落時(shí)挑取單菌落于NB液體培養(yǎng)基中，于260 r·min-1的搖床中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水配制成濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

1.2.2 不同接種方法比較 待番茄幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉后，使用上述制備好的濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，分別采用剪頂法、莖上針刺法、浸根法、拌土法等4種方法進(jìn)行接種。具體接種方法如下。

剪頂法：將14 cm手術(shù)剪（型號(hào)：PTJ -3）的前端1 cm 蘸取菌懸液，在番茄幼苗新葉處將主莖剪斷（羅來鑫 等，2005），以蘸取無菌水接種為對(duì)照。

莖上針刺法：用注射器吸取菌懸液，針刺接種到番茄主莖上，從莖基部開始往上每隔1 cm進(jìn)行針刺，每株幼苗針刺接種3處，以針刺無菌水接種為對(duì)照。

浸根法：將番茄幼苗從穴盤中輕輕拔起，用清水沖洗掉根部泥土，在根尖端剪去2 cm左右后，將幼苗的根系在菌懸液中浸泡30 min，然后栽種到育苗基質(zhì)中（羅來鑫 等，2005），以無菌水接種為對(duì)照。

拌土法：將200 mL菌懸液與800 g育苗基質(zhì)混合，充分?jǐn)嚢杈鶆颍玫浇K濃度為2×107cfu·g-1的帶菌基質(zhì)，將催芽后的番茄種子播種到帶菌基質(zhì)中，以無菌育苗基質(zhì)為對(duì)照。

以上4種接種方法，每種方法設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)20株。接種后，將番茄幼苗放入接種鑒定保濕柜中，保濕培養(yǎng)（RH為90%～100%）48 h，之后正常管理。白天溫度25～28 ℃，晚上20～22℃，平均濕度為80%～90%。定期觀察病情發(fā)展情況，并及時(shí)對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行記錄和拍照。

1.2.3 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 番茄潰瘍病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，葉片（或子葉）未出現(xiàn)萎蔫或莖壞死；1 級(jí)，葉片（或子葉）輕度變黃或萎蔫；2級(jí)，葉片（或子葉）中度萎蔫或莖輕度壞死；3 級(jí)，葉片（或子葉）嚴(yán)重萎蔫或莖嚴(yán)重壞死；4 級(jí)，植株死亡（曹春梅 等，2008；陳磊 等，2017）。計(jì)算潰瘍病的發(fā)病率及病情指數(shù)。

發(fā)病率=（病株數(shù)/接種株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=〔Σ（病級(jí)數(shù)值×該病級(jí)株數(shù)）〕/（病級(jí)最高值×調(diào)查株數(shù)）×100

1.2.4 微生物菌劑對(duì)番茄潰瘍病的防效測(cè)定 在番茄3～4片真葉期，分別施用23種微生物菌劑1 000倍稀釋液（有效濃度為活芽孢0.2億個(gè)·g-1），對(duì)照藥劑為60%溴硝醇可濕性粉劑800倍液，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑800倍液，3%中生菌素可濕性粉劑600倍液。施藥24 h后，采用剪頂法接種番茄潰瘍病菌，接種后放置于保濕柜中，溫度25～28 ℃、濕度80%～90%條件下常規(guī)管理，待清水對(duì)照充分發(fā)病后調(diào)查病情指數(shù)，并計(jì)算防效。

防效=〔（對(duì)照平均病情指數(shù)-處理平均病情指數(shù)）/對(duì)照平均病情指數(shù)〕×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft 2010和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄潰瘍病不同接種方法的比較

采用不同的接種方法，番茄潰瘍病發(fā)病時(shí)間和表現(xiàn)癥狀不同。剪頂法接種后4 d番茄幼苗呈現(xiàn)明顯的潰瘍病癥狀，新葉萎蔫，主莖壞死，維管束變褐腐爛（圖1-a）；莖上針刺法接種后7 d表現(xiàn)癥狀，番茄幼苗莖部條狀枯萎和開裂，個(gè)別植株葉片萎蔫（圖1-b）；浸根法和拌土法接種后，番茄潰瘍病潛育期較長(zhǎng)，均在接種后14 d表現(xiàn)癥狀，且癥狀表現(xiàn)一致，葉片萎蔫變黃，莖表面生出較多不定根或刺狀突起，主莖無壞死現(xiàn)象（圖1-c、d）。

圖1 番茄潰瘍病不同接種方法的比較

從表1可以看出，采用不同的接種方法，番茄潰瘍病發(fā)病率和病情指數(shù)有所差異。剪頂法和莖上針刺法接種，番茄潰瘍病發(fā)病率均高達(dá)100.00%，平均病情指數(shù)均高于90，顯著高于浸根法和拌土法接種。浸根法和拌土法接種，發(fā)病率分別為28.33%和38.33%，平均病情指數(shù)低于40。

綜合盆栽試驗(yàn)結(jié)果，剪頂法接種操作簡(jiǎn)單，病害癥狀明顯，且顯癥時(shí)間短，發(fā)病穩(wěn)定，是番茄潰瘍病菌致病性評(píng)價(jià)的最佳接種方法，適用于品種抗性鑒定和藥效評(píng)價(jià)。

表1 不同接種方法下番茄潰瘍病發(fā)病情況

2.2 23種微生物菌劑對(duì)番茄潰瘍病的預(yù)防效果

從表2可以看出，在對(duì)番茄潰瘍病的預(yù)防效果上，微生物菌劑芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 021號(hào)和芽孢IVF 020號(hào)防效最佳，分別為100.00%、100.00%和98.25%，微生物菌劑芽孢IVF 002號(hào)、芽孢IVF 005號(hào)和芽孢IVF 025號(hào)的防效也超過80%，均顯著高于對(duì)照化學(xué)藥劑60%溴硝醇可濕性粉劑、3%中生菌素可濕性粉劑和30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑。

可見，微生物菌劑芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 021號(hào)和芽孢IVF 020號(hào)預(yù)防效果最好，可作為防治番茄潰瘍病的備選藥劑，起到預(yù)防或減輕潰瘍病害發(fā)生的作用。

表2 23種微生物菌劑對(duì)番茄潰瘍病的預(yù)防效果

3 結(jié)論與討論

番茄潰瘍病是一種維管束系統(tǒng)病害，從育苗到收獲期均可發(fā)生，病原菌通常從植物的各種傷口或表皮的毛孔、水孔等自然孔口侵入，病原菌可以在土壤中存活2～3 a。根據(jù)番茄潰瘍病的初侵染源和侵入途徑，筆者選擇了剪頂法、莖上針刺法、浸根法、拌土法等4種不同的方法進(jìn)行接種。其中，浸根法的操作方法和發(fā)病癥狀與已報(bào)道的方法一致（羅來鑫 等，2004，2005），番茄部分葉片呈現(xiàn)不規(guī)則的輕度萎蔫變黃癥狀，病情指數(shù)較小，不適合作為番茄潰瘍病菌的致病性測(cè)定和抗病性鑒定。而本試驗(yàn)中剪頂法和莖上針刺法對(duì)已報(bào)道方法進(jìn)行了改進(jìn)，已報(bào)道的剪頂法是在番茄2～3片真葉期，用蘸有菌懸液的剪刀剪去子葉上部1～2 cm處主莖（羅來鑫 等，2005），本試驗(yàn)是在番茄3～4片真葉期，在幼苗新葉處將主莖剪斷，本試驗(yàn)方法對(duì)幼苗傷害更小，鑒定結(jié)果更為可靠。已報(bào)道的莖上針刺法是將蘸有菌懸液的接種針刺傷子葉與第1真葉之間的莖段，本試驗(yàn)的針刺部位為莖基部往上每隔1 cm 1個(gè)針刺點(diǎn)，操作方法更易形成統(tǒng)一規(guī)范。筆者采用剪頂法和莖上針刺法接種后，番茄植株均表現(xiàn)出細(xì)菌性潰瘍病的典型癥狀，發(fā)病率達(dá)100%，病情指數(shù)高于90。而拌土接種法尚未見報(bào)道，筆者采用拌土法接種后，番茄下部葉片從邊緣開始變黃枯死，莖部生出較多不定根或刺狀突起，與田間自然發(fā)病癥狀相似，但該方法病害潛育期長(zhǎng)，發(fā)病率和病情指數(shù)均較低，可能跟病原菌接種濃度有關(guān)系。本試驗(yàn)采用4種方法接種后，番茄植株均表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀，后續(xù)應(yīng)用中可以根據(jù)不同的需求選擇不同的接種方法。在殺菌劑防效篩選中，本試驗(yàn)采用剪頂法接種番茄潰瘍病菌，接種后發(fā)病率和病情指數(shù)均較高，而且病害潛育期短，發(fā)病均勻、穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單。

番茄潰瘍病是一種世界公認(rèn)的毀滅性病害，已成為影響番茄生產(chǎn)的重要限制因素。芽孢桿菌（Bacillus sp.）作為一種新型的防病促生微生物細(xì)菌菌劑，具有耐熱、抗菌譜廣、低毒、低抗藥性、良好的有機(jī)溶劑耐受性等特點(diǎn)（王文橋 等，2011；路粉和王文橋，2017），是理想的生防菌選擇對(duì)象。本試驗(yàn)結(jié)果表明，23種微生物菌劑對(duì)番茄潰瘍病有明顯的預(yù)防效果，其中芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 021號(hào)和芽孢IVF 020號(hào)預(yù)防效果最佳，這與微生物菌劑的防治機(jī)制有關(guān)，芽孢桿菌及其代謝物不僅能抑制密執(zhí)安棍狀桿菌繁殖生長(zhǎng)并產(chǎn)生保護(hù)圈，而且能誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病（蔣志強(qiáng)和郭堅(jiān)華，2006；韓云 等，2015）。因此，在發(fā)病初期或之前及時(shí)用藥，既能夠顯著提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)（尹顯慧 等，2016），又能夠減少藥害的發(fā)生。本試驗(yàn)篩選出的微生物菌劑芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 021號(hào)和芽孢IVF 020號(hào)，有望成為番茄細(xì)菌性病害防治的高效生防藥劑，具有良好的推廣價(jià)值。