儲德韌，孫明星，劉 剛

(1.上?；ぱ芯吭河邢薰?國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心〔上?！?上海 200062； 2.上海出入境檢驗檢疫局工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心 上海 200135)

針對上述問題，目前世界各國，特別是中國、美國、歐盟等都正積極開展相關(guān)領(lǐng)域測試方法和限值的研究[17]，我國于2012年發(fā)布了世界上首份關(guān)于化肥中陰離子快速測定方法的國家標準[18]。在歐盟，以法國為主要成員之一的歐盟CEN TC 260“肥料和石灰質(zhì)材料”技術(shù)委員會第7工作組(WG 7)應歐盟委員會的要求，正在開展一項關(guān)于化肥中多種無機陰離子含量的離子色譜測試方法研究，其最終目的是通過相關(guān)法規(guī)與測試方法相結(jié)合，將歐盟境內(nèi)化肥中相關(guān)無機陰離子的含量降至50 mg/kg以下。雖然上述進展令人振奮，然而時至今日，面對國內(nèi)外各種新型肥料品種不斷涌現(xiàn)的現(xiàn)實，在全球范圍內(nèi)針對肥料中無機陰離子含量的統(tǒng)一的測定國際方法標準仍然缺失，這不僅給全球肥料貿(mào)易帶來不利影響，也不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的保護。

為了有效填補肥料中無機陰離子含量測定相關(guān)領(lǐng)域國際標準與規(guī)范的缺失，建立肥料中無機陰離子的辨識和控制體系，減輕對土壤、水源等環(huán)境的污染，達到保護環(huán)境、保證農(nóng)作物正常生長和農(nóng)產(chǎn)品安全、維護消費者健康等目的，同時也為肥料領(lǐng)域今后制定陰離子限量相關(guān)法規(guī)和建立我國主導的非關(guān)稅貿(mào)易壁壘提供技術(shù)支撐，維護肥料用戶的權(quán)益和規(guī)范全球肥料市場，上?；ぱ芯吭河邢薰九c上海出入境檢驗檢疫局合作，在GB/T 29400—2012[18]的方法基礎(chǔ)上進行了深入研究，于2015年12月向國際標準化組織ISO/TC134“肥料和土壤調(diào)理劑”標準化技術(shù)委員會申請了相關(guān)國際標準項目并獲得立項。該研究項目開發(fā)了采用離子色譜法測定肥料中微量無機陰離子含量的新方法，即采用陰離子交換色譜柱并配合電導檢測器，通過梯度洗脫或等度洗脫的策略，能有效地將肥料中6種常見陰離子與其他干擾物質(zhì)分離并準確測定。經(jīng)國際標準化組織ISO/TC134“肥料和土壤調(diào)理劑”標準化技術(shù)委員會推薦，由上?；ぱ芯吭河邢薰緺款^，會同上海出入境檢驗檢疫局組織了國內(nèi)外15家分析實驗室針對一系列有代表性的肥料樣品進行了國際實驗室間比對活動。通過對各參與實驗室提交的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果表明該新方法的適用性廣且精密度高，因此被推薦為新的國際標準ISO 20702[19]中所采用的標準方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex ICS- 2100型離子色譜儀，配恒溫電導檢測器，AERS 500型陰離子抑制器，DionexTMIonPac AS18陰離子分析柱，Thermo Fisher Scientific Inc.；Metrohm 881型離子色譜儀，配電導檢測器及抑制器，Metrosep A Supp 5陰離子分析柱，Metrohm China Ltd.；Millipore Simplicty超純水機，Merck Millipore Co., Ltd.；SK2510HP超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；Mettler Toledo AL204- 1C型分析天平，Mettler Toledo Co., Ltd.；一次性注射器以及水相濾頭(0.22 μm)，SPE- C18固相萃取小柱(1 mL)，鋇離子固相萃取小柱(1 mL)，Ag/H固相萃取小柱(1 mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 離子色譜條件

在國際標準草案文本ISO/FDIS 20702[19]及據(jù)此起草的國際實驗室間比對作業(yè)指導書中，提供了2套離子色譜條件，分別采用梯度洗脫或等度洗脫策略，可供標準操作人員依據(jù)本實驗室的具體條件進行選擇。在國際實驗室間比對作業(yè)指導書中，參與的實驗室人員也被允許采用其他色譜條件(色譜柱)，只要其能夠證明所采用的色譜條件(色譜柱)能夠達到與本國際標準草案文本ISO/FDIS 20702[19]中所描述的同樣的針對6種離子的分離效果，并在報告中備注其所采用的色譜條件(色譜柱)。

1.2.1 梯度洗脫色譜條件

采用DionexTMIonPac AS18陰離子分析柱(250 mm×4 mm)，柱溫30 ℃；淋洗液為淋洗液發(fā)生器生成的高純氫氧化鉀溶液，淋洗液流速1.0 mL/min；采用自動再生抑制模式；電導檢測器溫度為35 ℃。進樣量為25 μL，采用保留時間定性，峰面積定量。推薦的梯度淋洗程序設(shè)置如表1所示。

表1 推薦的梯度洗脫程序設(shè)置

時間/minOH-濃度/(mmol·L-1)0.001213.001214.008046.008047.001254.0012

1.2.2 等度洗脫色譜條件

Metrosep A Supp 5陰離子分析柱(250 mm×4 mm)，柱溫40 ℃；淋洗液為配置的高純碳酸鈉-碳酸氫鈉混合溶液并添加少量丙酮，淋洗液流速0.7 mL/min；電導檢測器溫度35 ℃。進樣量20 μL，采用保留時間定性，峰面積定量。

1.3 試驗方法

稱取已經(jīng)干燥、粉碎的肥料試樣1 g(精確至0.000 2 g)于100 mL容量瓶中，以超純水定容，搖勻后室溫下超聲浸提30 min，取部分上清液以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。用注射器取離心所得上清液5 mL，緩緩推過0.22 μm水相微孔濾頭后，再將試樣溶液緩緩推入活化后的SPE- C18固相萃取小柱、鋇離子固相萃取小柱及Ag/H固相萃取小柱(可選步驟，如果樣品溶液需要凈化)。棄去前2 mL溶液后所得的凈化液在上述離子色譜條件下進行測定，同時在相同的條件下進行空白試驗作為對照。

1.4 試驗樣品及參試機構(gòu)

考慮到盡可能具有代表性，國際實驗室間比對階段使用的肥料樣品種類包括磷酸一銨(樣品A)、硝基復合肥(樣品B)、氮磷鉀(NPK)復混肥料(樣品C)和硫酸鉀(樣品D)，4種樣品中6種無機陰離子的濃度范圍在10～1 700 mg/kg之間。

本次國際實驗室間比對活動經(jīng)國際標準化組織ISO/TC134“肥料和土壤調(diào)理劑”標準化技術(shù)委員會推薦，由上?；ぱ芯吭河邢薰緺款^，會同上海出入境檢驗檢疫局召集了包括捷克國家參考物質(zhì)實驗室農(nóng)業(yè)監(jiān)督和測試中心、美國CF工業(yè)控股公司、國家精細化學品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院、貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院、Metrohm中國有限公司、寧波出入境檢驗檢疫局、美國印地安那州化學家辦公室、泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、陜西省出入境檢驗檢疫局、山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、上?；ぱ芯吭河邢薰尽⑸虾３鋈刖硻z驗檢疫局、Thermo Fisher科學公司、云南省化工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站在內(nèi)的全球15家分析實驗室參與。

1.5 結(jié)果計算

(1)

V——試樣/空白溶液的體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值作為測定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準色譜圖分析

取6種無機陰離子的標準混合溶液，其中各離子的質(zhì)量濃度均為20.0 mg/L，分別在標準草案文本[19]推薦的梯度洗脫色譜條件還是等度洗脫色譜條件下進行測定，所得的6種陰離子標準色譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 梯度洗脫色譜條件下6種陰離子標準色譜圖

圖2 等度洗脫色譜條件下6種陰離子標準色譜圖

由圖1和圖2可以看出，無論是標準草案文本[19]推薦的梯度洗脫色譜條件還是等度洗脫色譜條件，都能將6種陰離子及其他雜質(zhì)在1 h內(nèi)完成有效分離，這可為分離測定肥料中6種無機陰離子提供更多的選擇。

2.2 比對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計研究

國際實驗室間比對研究依據(jù)ISO關(guān)于國際標準項目制定相關(guān)程序[20]，按照國際標準草案文本ISO/FDIS 20702[19]及據(jù)此起草的國際實驗室間比對作業(yè)指導書進行；比對試驗數(shù)據(jù)依據(jù)ISO 5725- 2:1994《測量方法與結(jié)果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現(xiàn)性的基本方法》(以下簡稱ISO 5725- 2:1994第2部分)[21]進行統(tǒng)計分析。鑒于15家實驗室對肥料中所有6種陰離子的測試數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)量非常龐大，且針對各種離子的測試結(jié)果數(shù)理統(tǒng)計步驟相類似，現(xiàn)以針對肥料中碘離子(I-)的測試結(jié)果統(tǒng)計為例對此過程展開說明。

2.2.1 原始數(shù)據(jù)及色譜條件

15家實驗室之中的12家成功完成了編號為A～D的4種肥料樣品中碘離子(I-)含量的測定，各實驗室報告中所采用的色譜條件(色譜柱)及原始數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 12家實驗室測定4種肥料樣品中碘離子(I-)含量采用的色譜條件(色譜柱)及原始數(shù)據(jù)

實驗室編號i色譜柱肥料樣品中碘離子(I-)含量水平j(luò)/(mg·kg-1)ABCD1AS-181 8501 844254.2265.6130.5132.971.5576.612AS-181 7441 759221.7247.4113.2121.957.2058.903Metrosep A Supp 51 6331 649270.2267.5134.2132.463.2163.934AS-191)1 6011 609208.8204.885.486.15AS-181 5251 536181.0180.0107.0105.06AS-181 8241 796230.1238.6118.0119.862.7663.507AS-181 7501 751219.7220.4121.8122.069.9569.958AS-181 7501 751219.6220.3121.9122.169.9969.959AS-181 6631 612240.0229.0135.7135.764.1870.9410Metrosep A Supp 71)1 6261 642212.8214.7121.4121.411AS-191)1 6031 709200.4277.299.8101.149.1549.0112AS-181 2191 310

注：1)實驗室4、10和11未采用國際標準草案文本ISO/FDIS 20702[19]中所推薦的2種色譜柱

2.2.2 數(shù)據(jù)一致性和離群性檢驗

根據(jù)ISO 5725- 2:1994第2部分[21]，在對采用實驗室間比對所得到的測定數(shù)據(jù)進行平均值和精密度參數(shù)計算之前，必須對數(shù)據(jù)的有效性(一致性)進行統(tǒng)計檢驗，剔除對結(jié)果可能造成干擾的離群值，確保數(shù)理統(tǒng)計結(jié)果的可靠性。

2.2.2.1 Mandel檢驗

首先采用Mandel的實驗室間一致性統(tǒng)計量h和實驗室內(nèi)一致性統(tǒng)計量k來檢驗上述原始數(shù)據(jù)的一致性：對每個實驗室(i)的每個水平(j)，計算實驗室間的一致性統(tǒng)計量h和每個實驗室內(nèi)的一致性統(tǒng)計量k，以每個實驗室的不同水平為一組進行描點作圖，每組內(nèi)的數(shù)據(jù)順序按碘離子(I-)含量水平j(luò)從低到高為順序排列，得到的Mandelh圖和k圖分別如圖3和圖4所示。

圖3和圖4中斜線填充的柱狀數(shù)據(jù)表示該數(shù)據(jù)超過了顯著性水平為5%時的Mandel統(tǒng)計量h與k的臨界值，從而是歧離值；水平線填充的柱狀數(shù)據(jù)表示該數(shù)據(jù)超過了顯著性水平為1%時的Mandel統(tǒng)計量h與k的臨界值，從而是離群值。

由圖3可知：實驗室4在樣品C的測定中出現(xiàn)了歧離值，實驗室5在樣品B的測定中出現(xiàn)了歧離值，實驗室11在樣品D的測定中出現(xiàn)了歧離值；實驗室12在樣品A的測定中出現(xiàn)了離群值。由圖4可知：實驗室9在樣品D的重復性測定結(jié)果有較大的變異，實驗室12在樣品A的重復性測定結(jié)果有較大的變異；實驗室2在樣品C的重復性測定結(jié)果有很大的變異，實驗室11在樣品A和B的重復性測定結(jié)果有很大的變異。根據(jù)Mandel統(tǒng)計圖的結(jié)果，需要采用數(shù)值離群檢驗方法對上述原始數(shù)據(jù)進行進一步的統(tǒng)計分析。

圖3 按12家實驗室數(shù)據(jù)進行分組的Mandel實驗室間一致性統(tǒng)計量h值

圖4 按12家實驗室數(shù)據(jù)進行分組的Mandel實驗室內(nèi)一致性統(tǒng)計量k值

2.2.2.2 Cochran檢驗

實驗室間比對數(shù)據(jù)有效性的一項重要假設(shè)是各參與實驗室所提交的數(shù)據(jù)的實驗室內(nèi)方差沒有顯著差異[22- 23]。根據(jù)ISO 5725- 2:1994第2部分[21]的要求，首先采用針對實驗室內(nèi)一致性的Cochran檢驗法[24]對各實驗室的數(shù)據(jù)進行分析，計算得到的Cochran檢驗結(jié)果如表3所示。

表3 針對12家實驗室測定的碘離子(I-)含量數(shù)據(jù)的首輪Cochran檢驗結(jié)果

項目 ABCDCochran統(tǒng)計量C1)0.4710.8530.8040.607歧離臨界值(5%)0.541(p=12,n=2)0.570(p=11,n=2)0.570(p=11,n=2)0.680(p=8,n=2)離群臨界值(1%)0.653(p=12,n=2)0.684(p=11,n=2)0.684(p=11,n=2)0.794(p=8,n=2)

注：1)如果計算所得Cochran統(tǒng)計量C大于置信水平5%臨界值但小于等于置信水平1%臨界值，則對應的被檢驗項目為歧離值；如果計算所得Cochran統(tǒng)計量C大于置信水平1%臨界值，則對應的被檢驗項目為離群值

由表3可以發(fā)現(xiàn)，在2個碘離子含量水平(j)上(B和C)，Cochran統(tǒng)計量C的計算結(jié)果分別超出了其對應的顯著水平為1%時的離群臨界值，表明針對4個碘離子(I-)含量水平(j)的樣品測試中，有的實驗室數(shù)據(jù)不能用于進一步的統(tǒng)計分析，此結(jié)果與圖4所得到的直觀結(jié)果基本符合。經(jīng)進一步分析原始數(shù)據(jù)，實驗室11和實驗室2分別在樣品B和樣品C的碘離子(I-)含量水平測定中所測得的數(shù)據(jù)絕對差異常大，這2個測定結(jié)果應當予以剔除。

經(jīng)首輪Cochran統(tǒng)計檢驗剔除上述2個數(shù)據(jù)后，再次采用針對實驗室內(nèi)一致性的Cochran檢驗法[24]對各實驗室剩余的數(shù)據(jù)進行分析，第2輪計算得到的Cochran檢驗結(jié)果如表4所示。

表4 針對12家實驗室測定的碘離子(I-)含量數(shù)據(jù)的第2輪Cochran檢驗結(jié)果

項目ABCDCochran統(tǒng)計量C0.4710.6520.3080.607歧離臨界值(5%)0.541(p=12,n=2)0.602(p=10,n=2)0.602(p=10,n=2)0.680(p=8,n=2)離群臨界值(1%)0.653(p=12,n=2)0.718(p=10,n=2)0.718(p=10,n=2)0.794(p=8,n=2)

第2輪Cochran檢驗結(jié)果表明，舍棄2個離群數(shù)據(jù)之后，12家實驗室剩余的數(shù)據(jù)在水平B和水平C的Cochran統(tǒng)計量C分別為0.652和0.308，均小于其對應的顯著水平為1%時的離群臨界值，表明此時的數(shù)據(jù)已經(jīng)不存在方差有顯著差異的離群值。

2.2.2.3 Grubbs檢驗

Grubbs檢驗是針對實驗室間數(shù)據(jù)一致性進行的數(shù)理檢驗[25- 26]，此處檢驗的對象是通過Cochran檢驗后保留的數(shù)據(jù)。對12家實驗室的數(shù)據(jù)進行計算得到的Grubbs檢驗結(jié)果如表5所示。

表5 針對12家實驗室測定的碘離子(I-)含量數(shù)據(jù)的Grubbs檢驗結(jié)果

項目有效數(shù)據(jù)個數(shù)/個單側(cè)低值單側(cè)高值雙側(cè)低值雙側(cè)高值數(shù)據(jù)類型A122.5501.2390.737 50.248 8B101.8371.6300.417 30.417 3C102.0121.1320.708 20.708 2D81.9291.2140.664 60.664 6Grubbs統(tǒng)計量歧離臨界值(5%)p=122.4122.4120.253 70.253 7p=102.2902.2900.186 40.186 4p=82.1262.1260.110 10.110 1Grubbs統(tǒng)計臨界值離群臨界值(1%)p=122.6362.6360.173 80.173 8p=102.4822.4820.115 00.115 0p=82.2742.2740.056 30.056 3

注：1)對于單側(cè)離群值的Grubbs檢驗，如果計算所得Grubbs統(tǒng)計量G大于置信水平5%臨界值為歧離值，大于置信水平1%臨界值為離群值；

2)對于雙側(cè)離群值的Grubbs檢驗，如果計算所得Grubbs統(tǒng)計量G小于置信水平5%臨界值為歧離值，小于置信水平1%臨界值為離群值

2.2.3 平均值和標準差的計算分析

表6 12家實驗室測定4種肥料中碘離子(I-)含量的平均值和標準差結(jié)果

項目ABCD有效實驗室數(shù)據(jù)數(shù)目/個1211118剔除的離群值數(shù)目/個0110碘離子(I-)含量平均值x(水平)/(mg·kg-1)1 657227.3117.764.42重復性標準差Sr31.537.120.962.17再現(xiàn)性標準差SR155.3125.9715.898.10

上述結(jié)論是通過有12個實驗室參與的一致性水平試驗獲得的，其中實驗室11在樣品B的碘離子(I-)含量水平測試中所測數(shù)據(jù)、實驗室2在樣品C的碘離子(I-)含量水平測試中所測數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計檢驗證明為離群值而被事先排除。

2.3 6種陰離子數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果匯總

表7 6種陰離子含量平均值與對應的重復性限及再現(xiàn)性限之間的函數(shù)關(guān)系

陰離子重復性限r(nóng)/(mg·kg-1)再現(xiàn)性限R/(mg·kg-1)F-10.4240.484x0.889Cl-0.015x+9.6850.137x+16.564Br-0.011x+1.3360.056x+29.554I-0.050x+2.3100.255x+11.595NO-20.339x0.88220.020SCN-0.140x0.8020.168x+11.155

注：1)重復性限r(nóng)與重復性標準差Sr之間的函數(shù)關(guān)系采用r=2.8Sr；再現(xiàn)性限R與重復性標準差SR之間的函數(shù)關(guān)系采用R=2.8SR

2.4 參與比對活動的實驗室反饋

通過全球15家實驗室協(xié)作完成的國際實驗室間比對活動，不僅考察了所研究開發(fā)的離子色譜方法的普適性及精密度，而且在試驗過程中得到了一些參與實驗室的寶貴反饋意見，對該國際標準方法的進一步規(guī)范化具有積極意義。

(2)實驗室2觀測到肥料樣品A中的實測氟(F-)含量隨前處理過程中的超聲時間不同而有所差異。這可能是由于超聲時間會影響樣品中6種陰離子含量的測定結(jié)果，這也是在標準中規(guī)定統(tǒng)一超聲時間為30 min的原因。

2.5 國際實驗室間比對結(jié)果討論

為確定國際標準草案文本ISO/FDIS 20702[19]中開發(fā)的離子色譜方法的適用性和精密度，對肥料樣品中的6種陰離子含量開展了國際間實驗室比對試驗。在試驗方案實施過程中，共征集到實驗室15家，最終15家實驗室提供了試驗結(jié)果。

試驗結(jié)果的精密度按ISO 5725- 2:1994第2部分[21]進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)有部分離群值，但沒有離群實驗室，所產(chǎn)生的離群值都是由隨機誤差所引起。精密度結(jié)果表明研究開發(fā)的肥料中6種微量無機陰離子含量的測定——離子色譜法是可行的，各實驗室間的測定值有較好的一致性，經(jīng)統(tǒng)計得到的精密度結(jié)果能用來確定試驗方法的重復性限和再現(xiàn)性限。

3 結(jié)語

在國家標準《化肥中微量陰離子的測定 離子色譜法》(GB/T 29400—2012)的基礎(chǔ)上，一種新的采用離子色譜方法測定肥料中6種微量無機陰離子含量的方法得以建立。新方法采用陰離子交換色譜柱，配合電導檢測器，通過梯度洗脫或等度洗脫的策略，能有效地將肥料中6種常見陰離子與其他干擾物質(zhì)分離并準確測定。經(jīng)國際標準化組織ISO/TC134“肥料和土壤調(diào)理劑”標準化技術(shù)委員會推薦，由上?；ぱ芯吭河邢薰緺款^，會同上海出入境檢驗檢疫局組織了國內(nèi)外15家分析實驗室針對一系列有代表性的肥料樣品進行了國際實驗室間比對活動，并針對各參與實驗室提交的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果表明該新方法的適用性廣且精密度高，被推薦為新的國際標準中所采用的標準方法。