徐宏輝 徐婧莎 何 俊* 浦靜姣 杜榮光 齊 冰

1(浙江省氣象科學(xué)研究所，杭州 310008)2(寧波諾丁漢大學(xué)， 化學(xué)環(huán)境工程系， 寧波315100) 3(杭州市氣象局， 杭州 310051)

1 引 言

生物質(zhì)燃燒是大氣氣溶膠和溫室氣體的重要來(lái)源[1～4]。生物質(zhì)燃燒排放污染物成分復(fù)雜，如何利用分子示蹤物更深入地研究生物質(zhì)燃燒對(duì)區(qū)域及局部地區(qū)大氣污染的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5～8]。水溶性鉀、左旋葡聚糖類化學(xué)物質(zhì)在氣溶膠粒子源解析研究中通常被用于表征生物質(zhì)燃燒。粒子中水溶性鉀產(chǎn)生于生物質(zhì)燃燒、海鹽和土壤揚(yáng)塵等過(guò)程，理論上講，使用水溶性鉀來(lái)估算生物質(zhì)燃燒會(huì)使結(jié)果偏高，因此近年來(lái)的研究多使用左旋葡聚糖類作為生物質(zhì)燃燒的示蹤物質(zhì)[9～11]。

大氣氣溶膠中生物質(zhì)燃燒有機(jī)示蹤物可被溶劑萃取，經(jīng)衍生化處理后由氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)法進(jìn)行分析[12,13]，但是衍生化處理過(guò)程復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，而且處理過(guò)程中不可避免地會(huì)造成待分析成分的損失，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，無(wú)需衍生化直接對(duì)左旋葡聚糖及異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)的分析法已有報(bào)道，如離子排斥色譜法[14]、高效液相色譜-脈沖安培檢測(cè)[15]、高效液相-氣溶膠電荷檢測(cè)[16]、高效液相-質(zhì)譜法以及離子色譜-脈沖安培檢測(cè)等[17,18]。其中，采用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)方法，左旋葡聚糖檢出限為60 μg/L(200 ng/m3)[18]；采用高效液相色譜-脈沖安培檢測(cè)方法，3種單糖類的檢出限在20～50 μg/L之間[15]；采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，以NaOH溶液為流動(dòng)相，該流動(dòng)相經(jīng)過(guò)離子源時(shí)會(huì)在高溫下析出晶體，堵塞離子源接口，從而可能對(duì)質(zhì)譜造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，該方法對(duì)3種目標(biāo)物的檢出限為30 μg/L[19]。這些方法對(duì)于檢測(cè)受氣溶膠污染較少的地區(qū)或氣溶膠濃度較低天氣的氣溶膠樣品具有一定局限性。

本研究利用高效液相色譜及三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)分析參數(shù)，建立了對(duì)上述3種目標(biāo)有機(jī)示蹤物無(wú)需衍生化處理過(guò)程即可進(jìn)行直接同時(shí)檢測(cè)的快速分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

HPLC-30A高效液相色譜儀(日本島津公司)； ABsciex 3200 Q trap三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-ESI-MS/MS，加拿大AB SCIEX公司)。

左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。稱取左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖各10.0 mg，用適量水溶解并定容至100 mL，得100 mg/L的單標(biāo)溶液，分別用水稀釋得5 mg/L單標(biāo)溶液。另取100 mg/L單標(biāo)溶液各1 mL混合，加水稀釋并定容至100 mL，得1 mg/L的混標(biāo)溶液，用于方法優(yōu)化。

2.2 液相色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱選用Dionex Carbopac MA1陰離子交換分析柱(250 mm×4 mm)及Carbopac MA1保護(hù)柱(50 mm×4 mm)，質(zhì)譜離子源采用電噴霧離子源。

流動(dòng)相為0.001%(w/V)氨水-水(10∶90，V/V)，流速設(shè)定為0.35 mL/min，柱溫箱溫度為45℃。最佳離子噴霧電壓設(shè)定為——3800 V，霧化氣氣壓設(shè)定為0.26 MPa，霧化溫度設(shè)定為650℃，輔助加熱氣氣壓設(shè)定為0.55 MPa，氣簾氣氣壓設(shè)定為0.32 MPa。進(jìn)樣量為10 μL。每?jī)蓚€(gè)樣品之間采用相同的液相條件平衡柱子3 min。

2.3 實(shí)際樣品采集和測(cè)定

在2014年11月12日～2015年11月12日，于長(zhǎng)三角地區(qū)4個(gè)采樣點(diǎn)利用大流量(1.05 m3/min)和中流量采樣儀(80 L/min)采集大氣中PM2.5樣品；采樣點(diǎn)包括：寧波諾丁漢大學(xué)、寧波氣象局、臨安區(qū)域本底站和杭州氣象局。采樣頻率為每6天1次，1次采樣24 h，空白樣品每月收集1次。大流量采樣使用玻璃濾膜(18.2 cm×23.2 cm，武漢天虹公司)；中流量采樣使用石英濾膜(直徑90 mm，Whatman公司)。采樣前濾膜在550℃下烘烤5 h，去除有機(jī)物殘留，采樣前后在恒溫恒濕的條件下平衡24 h后稱重，采樣后濾膜于——18℃保存，直至對(duì)樣品進(jìn)行提取分析。

采樣獲得的大流量氣溶膠樣品，剪取3 cm×3 cm的濾膜；獲得的中流量氣溶膠樣品，剪取1/8的濾膜，分別加入3 mL水，在室溫下超聲萃取45 min，然后過(guò)0.45 μm濾膜，用HPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 特征離子的選擇

3種目標(biāo)示蹤物和內(nèi)標(biāo)化合物偏中性，且含多個(gè)羥基，因此選擇負(fù)離子模式，手動(dòng)調(diào)整質(zhì)譜各分析參數(shù)，如碰撞能量(CE) 等，使各離子強(qiáng)度最高，每個(gè)離子的質(zhì)荷比(m/z)精確到0.1 amu。左旋葡聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖互為同分異構(gòu)體，擁有相同的母離子，即m/z160.9(表1)。左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖及甘露醇-1-13C的子離子見表1。

表1 目標(biāo)示蹤物及內(nèi)標(biāo)化合物的特征母離子及子離子質(zhì)荷比

Table 1 Parent ion (m/z) and product ion (m/z) of target compounds and internal standard

化合物Compound特征母離子Parent ion (m/z)特征子離子Product ion(m/z)生物質(zhì)燃燒示蹤物Biomass burning tracers左旋葡聚糖 Levoglucosan160.9101.0/113.0/129.0甘露聚糖 Mannosan160.9101.0/129.0半乳聚糖 Galactosan160.9101.0/113.0同位素內(nèi)標(biāo)化合物Internal standard甘露醇-1-13C Mannitol-1-13C182.059.0/71.0/89.1/101.0

3.2 高效液相色譜參數(shù)的優(yōu)化

左旋葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖均為極性碳水化合物，但極性有差別，本研究對(duì)高效液相色譜分析條件及參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選用適合單糖類分離的陰離子交換分析柱(CarboPac MA1, 250 mm×4 mm, 戴安公司)及保護(hù)住(CarboPac MA1, 50 mm×4 mm)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。該類色譜柱僅適用堿性溶液作為流動(dòng)相，考慮到NaOH溶液在高溫下會(huì)析出晶體，堵塞離子源接口，本研究采用氨水溶液(HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)證明，流動(dòng)相梯度濃度的改變對(duì)目標(biāo)物的分離和靈敏度影響不大，因此液相參數(shù)的優(yōu)化主要是對(duì)流動(dòng)相濃度、流速以及柱溫箱溫度進(jìn)行優(yōu)化。

氨水作為流動(dòng)相，通過(guò)改變流動(dòng)相濃度可以改變流動(dòng)相的pH值，從而改變柱子對(duì)樣品的保留，影響樣品的分離和保留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種有機(jī)示蹤物的分離受流動(dòng)相氨水濃度變化的影響不大，其原因可能是氨水為弱堿，在0.00001%～0.001%(w/V，約0.005～0.5 mmol/L)范圍內(nèi)，pH值變化不大(約為9～10)。但是3種有機(jī)示蹤物的峰值受流動(dòng)相氨水濃度變化的影響顯著。如圖1所示，左旋葡聚糖的峰值受流動(dòng)相濃度變化的影響最顯著，但由于它的峰值明顯高于其它兩種目標(biāo)物的峰值，且在空氣顆粒物中的濃度也明顯高于其它化合物，因此對(duì)流動(dòng)相濃度的優(yōu)化主要考慮其它兩種有機(jī)示蹤物。甘露聚糖和半乳聚糖在氨水流動(dòng)相濃度為0.0005%(w/V)時(shí)的峰值最高。因此，選定流動(dòng)相氨水的濃度為0.0005%(w/V，約0.264 mmol/L)。

采用不同的流速可得到不同的柱效，由于柱子的適用流速范圍為0.2～0.5 mL/min，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中，當(dāng)流速≥0.45 mL/min時(shí)，柱壓接近或超過(guò)最大值14 MPa，因此，考察流速為0.20、 0.25、 0.30、0.35和0.40 mL/min時(shí)的柱效。 如圖2所示，流動(dòng)相流速為0.35 mL/min時(shí)，3種目標(biāo)物峰值最高。因此，選擇流動(dòng)相流速為0.35 mL/min。

圖1 流動(dòng)相中氨水濃度的變化對(duì)目標(biāo)示蹤物甘露聚糖、半乳聚糖和左旋葡聚糖峰值信號(hào)的影響Fig.1 Optimization of concentration of ammonia in mobile phase for analysis of mannosan, galactosan and levoglucosan

圖2 流動(dòng)相流速對(duì)3種目標(biāo)示蹤物峰值的影響Fig.2 Effect of flow rate on peak intensities of mannosan, galactosan and levoglucosan

MA1分析柱耐受溫度為4℃～50℃，為確保柱子的柱效，長(zhǎng)時(shí)間使用柱子時(shí)，柱溫以不超過(guò)其最高溫度的90%為宜。柱溫越高，樣品保留時(shí)間越短，峰形越窄，峰的響應(yīng)值越高。考察柱溫為25、30、35、40 及 45℃時(shí)的分離情況。如圖3所示，當(dāng)柱溫低于35℃時(shí)，甘露聚糖和半乳聚糖未得到良好分離，且這兩種物質(zhì)擁有相同的母子離子對(duì)，不能用提取不同母子離子對(duì)的方式分別進(jìn)行定量分析。左旋葡聚糖在柱溫為40℃時(shí)峰值最高，而其它兩種目標(biāo)物在柱溫為45℃時(shí)峰值最高，由于這兩種化合物在空氣中的濃度明顯低于左旋葡聚糖，因此，為了能使所有待測(cè)物都能在較低濃度的情況下得到檢測(cè)，柱溫選擇45℃。

圖3 柱溫箱溫度變化對(duì)3種目標(biāo)示蹤物峰值的影響Fig.3 Effect of column temperature on peak intensities of mannosan, galactosan and levoglucosan

3.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，結(jié)合優(yōu)化后的液相色譜參數(shù)確定初步的LC-MRM方法。設(shè)定只有m/z160.9和m/z182.0的母離子(表1)能通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜(MS1/Q1)進(jìn)入碰撞室(q2)，設(shè)定在碰撞室被打碎的碎片子離子中m/z101.0、m/z113.0和m/z129.0等特征子離子(見表1)能通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜(MS2/Q3)并被最后的檢測(cè)器檢測(cè)；相同的母-子離子對(duì)的化合物參數(shù)相同。最后選擇豐度最高的母-子離子組合進(jìn)行定量分析，其它母-子離子組合用于定性分析。

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過(guò)程采用上述初步確定的LC-MRM方法，設(shè)定不同的離子源和化合物參數(shù)后，自動(dòng)進(jìn)樣分析。分析結(jié)束后，根據(jù)最高峰值的各參數(shù)選擇LC-MRM方法的質(zhì)譜參數(shù)。每個(gè)離子對(duì)的化合物參數(shù)都經(jīng)多次優(yōu)化后取最佳值，使其靈敏度最高，最終優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 優(yōu)化后的化合物質(zhì)譜參數(shù)

Table 2 Optimized mass spectrometric parameters

3.4 特征離子色譜圖

圖4 3種有機(jī)示蹤物和內(nèi)標(biāo)物甘露醇-1-13C的液質(zhì)聯(lián)用特征母子離子色譜圖Fig.4 HPLC-MS/MS chromatogram of 3 kinds of organic tracers and internal standard mannitol-1-13C

采用上述建立的高效液相色譜-質(zhì)譜方法對(duì)3種目標(biāo)示蹤物和內(nèi)標(biāo)物甘露醇-1-13C的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，它們的特征離子色譜圖見圖4。3種目標(biāo)化合物得到了良好的分離，甘露聚糖和甘露醇-1-13C有部分重疊，但由于這兩種物質(zhì)擁有不同的母-子離子對(duì)，因此，各離子對(duì)可分別從圖中提取，進(jìn)行定量分析。

3.5 方法分析性能

目標(biāo)有機(jī)示蹤物的檢出限、校準(zhǔn)曲線濃度范圍、線性系數(shù)及回收率、重復(fù)率見表3。 方法檢出限(LOD)定義為信噪比≥ 3時(shí)的化合物濃度。萃取液中的檢出限濃度同時(shí)換算為在空氣中的24 h日均濃度。如表3所示，萃取液中檢出限介于1.8 μg/L(左旋葡聚糖)和9.5 μg/L(半乳聚糖)之間，換算為大流量采樣器采集的空氣中的日均濃度為0.2～1.2 ng/m3，中流量采樣器采集的空氣中的日均濃度為0.4～2.0 ng/m3,都低于相關(guān)參考文獻(xiàn)中的檢出限[14～18]，說(shuō)明與其它的檢測(cè)方法相比，本方法對(duì)于較低濃度(ng/m3級(jí))的示蹤物有很好的檢測(cè)效果。

表3 高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿線性阱質(zhì)譜的分析方法評(píng)估結(jié)果

Table 5 Evaluation results of HPLC-ESI-MS/MS method

分析物Analyst檢出限 Limits of detection (LOD)萃取濃度Extractconcentration(μg/L)氣溶膠濃度aAerosolconcentration(ng/m3)氣溶膠濃度bAerosolconcentration(ng/m3)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍Concentrationrange(mg/L)重復(fù)率(標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積,n=5)Reproducibility(Standards, RSDof peak area, n=5)重復(fù)率(氣溶膠樣品峰面積,n=4)Reproducibility(Aerosol samples,RSD of peak area, n=4)加標(biāo)回收率Recovery ofspikedstandards(%)左旋葡聚糖Levoglucosan1.80.20.40.01～12.00.6108.4±1.6甘露聚糖Mannosan5.80.71.20.01～11.97.7104.7±1.8半乳聚糖Galactosan9.51.22.00.01～11.65.1106.5±1.9甘露醇-1-13CMannitol-1-13C5.6n.ac.n.ac0.01～11.6n.a.101.3±1.8a 24 h PM2.5 樣品, 1,512 m3 采樣空氣體積. 24 h PM2.5 sample, 1,512 m3 air sampling volume ; b 24 h PM2.5樣品, 115.2 m3采樣空氣體積. 24 h PM2.5 sample, 115.2 m3 air sampling volume; c甘露醇-1-13C 作為內(nèi)標(biāo)物在實(shí)際空氣顆粒物樣品中幾乎不存在,不能被檢測(cè)到。Mannitol-1-13C as internal standard is not present in actual air and cann't be detected.

結(jié)合目標(biāo)物的保留時(shí)間和特征離子對(duì)3種目標(biāo)示蹤物以及內(nèi)標(biāo)物甘露醇-1-13C進(jìn)行定性分析，用豐度最高的離子對(duì)對(duì)3種目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，定量分析采用外標(biāo)曲線法，線性方程見表5，3種化合物具有良好的線性關(guān)系(R> 0.999)。為了確保方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，測(cè)試開始前和結(jié)束后都需要進(jìn)行校準(zhǔn)標(biāo)線，多次進(jìn)樣后也需要進(jìn)樣一次標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品以及實(shí)際氣溶膠樣品的重現(xiàn)性(重復(fù)率)測(cè)試結(jié)果見表5。標(biāo)準(zhǔn)樣品的5次重復(fù)測(cè)試，3種目標(biāo)化合物的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都小于2.2%；對(duì)于實(shí)際氣溶膠樣品的4次重復(fù)測(cè)試，左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的峰面積RSD分別為0.6%、7.7%和5.1%，盡管甘露聚糖和半乳聚糖峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)較高，但由于它們?cè)跉馊苣z中的濃度也相對(duì)較高，對(duì)實(shí)際濃度測(cè)定的影響不大，因此，本方法的重現(xiàn)性良好。

同時(shí)，還對(duì)加標(biāo)空白樣的回收率進(jìn)行了測(cè)試。提前烘烤過(guò)的5張90 mm空白濾膜樣品經(jīng)測(cè)試不含上述目標(biāo)化合物或其濃度低于檢出限，然后將每張空白膜剪取相同1/8張的大小，加入100 mg/L的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的單標(biāo)溶液各30 μL，常溫干燥，剪碎，加入3 mL水進(jìn)行超聲萃取45 min，過(guò)濾萃取液，用建立的方法檢測(cè)，結(jié)果見表5，左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的回收率分別為108.4%± 1.6%、104.7%± 1.8%和106.5%± 1.9%。用本方法可直接同時(shí)檢測(cè)3種示蹤物，各示蹤物的檢出限均達(dá)到ng/m3級(jí)，且回收率高，檢測(cè)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，方法穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

建立了高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜分析方法，對(duì)左旋葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖3種生物質(zhì)燃燒有機(jī)示蹤物無(wú)需衍生化處理過(guò)程即可直接同時(shí)檢測(cè)，有助于提高該類氣溶膠成分的檢測(cè)效率，并降低了檢測(cè)成本。本方法檢出限低、靈敏度高、樣品回收率高、重現(xiàn)性好，為生物質(zhì)燃燒類氣溶膠的日常分析提供了一種簡(jiǎn)單、可靠、高效、準(zhǔn)確的分析方法，也為氣溶膠的源解析工作提供了可靠依據(jù)。