孫偉玲，鄭丹丹，周永明

上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類常見的造血系統(tǒng)惡性增殖性疾病，在成人急性白血病中最為多見［1-2］。白血病細胞具有較強的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，此類細胞大量增生，侵犯髓外器官及其他組織，是白血病臨床緩解后復發(fā)的一個重要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶［3-4］(MMPs)是一類對鋅有依賴的蛋白水解酶，可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解酶和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶4種。其中明膠酶(包括MMP-2、MMP-9)能降解細胞外基質(zhì)IV型膠原，在惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用。已有研究表明，急性髓系白血病細胞可分泌MMP-2和MMP-9［5-6］，本實驗研究用不同濃度定清片含藥血清對急性髓系白血病HL-60細胞進行干預，觀察定清片對HL-60細胞侵襲力的影響，以明確白血病發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移的部分機理。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物 人急性髓系白血病細胞株HL-60購自中科院上海細胞生物研究所批號：CBP420247，20只成年雄性SD大鼠購自上海西普爾-必凱有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(滬)2013-001。

1.2 主要儀器與試劑 型細胞培養(yǎng)箱(ThermoForma 3311)；超凈臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司，SA-960-2)；Neofugel 5型高速冷凍離心機(Heal Force，Neofuge15)；IX53 型 倒 置 顯 微 鏡(OLYMPUS，IX53)；Mini P-4 電泳槽(Cavoy，MP-8120)；MP-8120 型濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy，MP-3030)；MP-3030型電泳儀(Bio-Rad，CBJ-IMR2-001)。RPMI-1640培養(yǎng)液批號：(HyClone，AAJ206660)、小牛血清購自 HyClone公司批號：(HyClone，GXM0109)；雙抗溶 液 (MULTICELL，450201013)；蛋 白 酶 抑 制 劑(sigma，T9128)；蛋白抽提試劑(碧云天，P0028)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，批號：P0010)。

1.3 藥物 定清片(我院院內(nèi)制劑，主要由太子參、雄黃、梔子、陳皮、甘草等組成)，批準文號：滬衛(wèi)藥劑98-090，規(guī)格：0.1 g/片。

1.4 含藥血清的制備 定清片規(guī)格：0.1 g/片，成人(60 kg)日用臨床劑量為4片/次，3次/d口服，相當于20 mg/kg·d-1。人和大鼠之間換算：20 mg/kg×60 kg×0.018/0.2 kg=108 mg/kg·d-1(大鼠)，相當于成人每日劑量約6.2倍。故大鼠劑量按照人劑量的6.2倍來進行灌胃。將20只SD大鼠隨機分為正常對照和定清片2組，對照組5只，定清片組15只。定清片組以定清片混懸液灌胃，空白組以同等量的生理鹽水灌胃。每只大鼠每次灌胃容量為1mL/100g，各組連續(xù)給藥3天，3次/d，于第4日晨末次給藥后2 h，腹腔麻醉，無菌條件腹主動脈采血，3 000 r/min離心15分鐘，56℃水浴滅活30分鐘，-80℃冷藏備用，用前無菌過濾，使用時稀釋至所需濃度。

1.5 實驗分組 將上述制備的含藥血清，分別稀釋成5%、10%、20%3種不同濃度，并用這3種不同濃度的藥物對急性髓系白血病HL-60細胞進行體外干預，另設一空白對照組(用培養(yǎng)液補足)，培養(yǎng)48小時后行相關蛋白檢測。

1.6 細胞培養(yǎng) 配制含10%小牛血清、1%雙抗溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-60細胞株，細胞起始濃度1×105/mL，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行實驗。

1.7 Transw el l實驗 將4℃化解的基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基對倍稀釋，均勻涂布于4℃預冷的Transwell培養(yǎng)小室膜的上表面，每孔加入100μL。置37℃培養(yǎng)箱30分鐘，取出后用無菌PBS緩沖液洗3次。用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×105/mL，接種到Transwell培養(yǎng)板的上層小室中，每孔接種100μL，并加入無血清培養(yǎng)基200μL。Transwell培養(yǎng)板的下層小室中每孔加入500 μL含10%FBS的培養(yǎng)液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱24小時。將培養(yǎng)24小時的Transwell培養(yǎng)板的上層小室取出，收集培養(yǎng)板孔內(nèi)細胞并計數(shù)。

1.8 W est ern Bl ot檢測 向細胞沉淀中加入冷的RIPA裂解液500 μL裂解細胞，然后15 000 r/min 4℃離心30分鐘，取上清于干凈EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后將PVDF膜取下置于濕盒中用5%BSA封閉2小時，按1∶1 000加入一抗，4℃搖床過夜。用PBS將PVDF膜洗滌3次，每次15分鐘，按1∶5 000比例加入二抗，室溫反應1小時。再次用PBS將PVDF膜洗滌3次，每次15分鐘，混合等體積化學發(fā)光劑AB液，與PVDF膜共孵育1分鐘，放入Bio-Rad化學發(fā)光儀檢測，并對檢測結果進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料用(±s)表示，符合正態(tài)分布及方差齊性的使用t檢驗或方差分析，不符合正態(tài)分布及方差齊性的使用非參數(shù)檢驗，組間采用LSD-t檢驗進行多重比較；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 定清片對H L-60細胞侵襲力的影響 侵襲細胞數(shù)不同濃度定清片含藥血清干預組均較空白組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；5%定清片血清組與10%定清片血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；20%定清片血清組與5%定清片血清組與10%定清片血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 定清片對H L-60細胞侵襲力的影響

2.2 定清片對HL-60細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響 HL-60細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達水平不同濃度定清片含藥血清干預組均較空白組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；5%定清片血清組與10%定清片血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；20%定清片血清組與5%定清片血清組與10%定清片血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 2、圖 1。

表2 定清片對M M P-2、M M P-9蛋白表達量的影響

圖1 不同濃度定清片含藥血清對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

3 討論

浸潤、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的常見生物學特性［7］，也是造成患者死亡的重要原因之一。大量研究證實［8-11］，MMPs在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程中扮演著至關重要的角色。其促進腫瘤細胞侵襲增長的主要機制如下：1)促進腫瘤血管新生，為腫瘤生長提供營養(yǎng)物質(zhì)；2)增強腫瘤細胞黏附力，促進其浸潤生長；3)破壞周圍正常細胞表面的基質(zhì)屏障，以便腫瘤細胞對其進行侵襲；4)參與腫瘤的免疫應答過程，促進腫瘤細胞或誘導其他細胞產(chǎn)生MMP-2、MMP-9。

AML是一類具有高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，它的發(fā)生和髓外浸潤都是多基因參與、多步驟、多因素的復雜過程［12］。有研究［5-6］顯示，AML患者骨髓中大量原始及幼稚細胞異常增生，在MMP-2和MMP-9的作用下穿過血管內(nèi)皮細胞的基底膜，從而對全身各器官、組織進行侵襲浸潤，整個過程中MMP-2和MMP-9發(fā)揮著重要作用。

定清片是我院血液科黃振翹教授、周永明教授在“扶正祛邪”理論指導下，多年潛心研究、逐步改良而成的治療白血病的有效制劑。其主要成分為太子參、雄黃、梔子、陳皮、甘草等。方中諸藥配伍，清補兼施，補中有清，共奏益氣養(yǎng)陰、清解邪毒之功。

本實驗研究采用Transwell實驗檢測定清片含藥血清對細胞侵襲力的影響，結果發(fā)現(xiàn)HL-60細胞可以穿過涂有基質(zhì)膠的Transwell培養(yǎng)小室膜，具有一定的侵襲能力。且不同濃度定清片含藥血清干預組侵襲細胞數(shù)較空白組減少，隨著藥物濃度的逐漸增加，定清片對HL-60細胞侵襲力的抑制作用越明顯。研究進一步采用Western Blot檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)定清片可以降低HL-60細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平，且隨著藥物濃度的升高，其下調(diào)MMP-2及MMP-9蛋白表達更為顯著。通過以上結果可知，定清片可抑制細胞侵襲力、下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達，可能是定清片抑制HL-60細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的一部分機制。