李紅丹 閆 蕾 孫 蕾 樊曉聰 陳士瞻 張 燕郭 林 游光霞 李 莊 楊宗舉 蘇 亮,* 楊建平,*

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玉米隱花色素和基因轉(zhuǎn)錄豐度對不同光質(zhì)處理的響應(yīng)

李紅丹1,2閆 蕾1,2孫 蕾1,2樊曉聰1,3陳士瞻1,3張 燕1,3郭 林1游光霞1李 莊1,2楊宗舉1,2蘇 亮1,*楊建平1,3,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450002

玉米株高、開花期、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀與環(huán)境中的光密切相關(guān)。隱花色素是一類藍(lán)光和近紫外光的受體, 主要參與植物的光形態(tài)建成及動、植物的生物鐘調(diào)控。通過研究玉米隱花色素基因?qū)Σ煌馓幚淼谋磉_(dá)模式, 可為進(jìn)一步研究其對玉米光形態(tài)建成的作用奠定基礎(chǔ)。本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆了玉米和基因; 利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站和軟件對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域及氨基酸進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析; 利用qRT-PCR分析了玉米自交系B73中和基因在不同組織、以及響應(yīng)不同光質(zhì)及長日照和短日照處理的轉(zhuǎn)錄豐度。研究發(fā)現(xiàn), 玉米與擬南芥、水稻和小麥的CRY蛋白有相同的結(jié)構(gòu)域及較高的氨基酸序列的一致性, 表明它們具有相似的功能。和基因主要在玉米的葉片中表達(dá); 二者能迅速響應(yīng)各種持續(xù)光質(zhì)、黑暗到不同光質(zhì)轉(zhuǎn)換及長日照和短日照處理, 且在各種處理下的轉(zhuǎn)錄豐度均高于, 可能暗示在玉米中功能更強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明,和基因均能有效地響應(yīng)各種光質(zhì)和光周期處理, 并在玉米的光形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步探明和基因的功能及其在玉米品種改良中的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

玉米; 隱花色素; 光形態(tài)建成; 光處理; 轉(zhuǎn)錄豐度

環(huán)境中光的輻照度、方向與光質(zhì)能顯著影響植物的株高、株型、產(chǎn)量、品質(zhì)等[1-5]。光照不僅是植物進(jìn)行光合作用的能量來源, 更能調(diào)控其生長與發(fā)育，如光形態(tài)建成等。在長期的進(jìn)化中, 植物逐步形成三大類光受體, 光敏色素(phytochrome), 主要負(fù)責(zé)感知紅光(波長為620~700 nm)和遠(yuǎn)紅光(700~800 nm); 隱花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin), 主要感知藍(lán)光(380~500 nm)和UV-A (320~380 nm); UVR8, 能特異性地吸收UV-B (280~ 320 nm)[6-8]。其中, 隱花色素是一種分子量為70~80 kD的黃素類蛋白, 有氨基端PHR和羧基端CCE兩個明顯的功能域, 其氨基端的PHR非共價地結(jié)合生色團(tuán)FAD和葉酸[6]。隱花色素是一種類光解酶的光受體, 參與了動物、植物乃至微生物中的光反應(yīng)及生物鐘的調(diào)控[8]。通過研究在不同條件下玉米隱花色素的表達(dá)模式, 可為進(jìn)一步研究其對玉米光形態(tài)建成的作用, 進(jìn)而認(rèn)知玉米光的反應(yīng)能力奠定基礎(chǔ)。

在擬南芥[9-10]、番茄[2-3,11]、蘋果[12]、水稻[13-14]、豌豆[4,15]、蕨類[16]、苔蘚[5,17]、大豆[18-19]、甘藍(lán)型油菜[20]等植物中的研究表明, 隱花色素不僅控制下胚軸的伸長、光周期誘導(dǎo)的開花及生物鐘的輸出, 還參與了向性生長、頂端優(yōu)勢、細(xì)胞程序性死亡、種子休眠、根的發(fā)育、氣孔開張等過程。模式植物擬南芥中存在3種類型的隱花色素, 即CRY1、CRY2和CRY3。在藍(lán)光下, CRY1和CRY2負(fù)責(zé)調(diào)控植物的去黃化與開花期。在藍(lán)光下, CRY1通過抑制COP1/SPA1的E3泛素連接酶活性, 導(dǎo)致正向調(diào)控因子HY5的積累, 從而促進(jìn)光形態(tài)建成并抑制下胚軸的伸長, 而突變體則表現(xiàn)為下胚軸伸長且子葉生長緩慢[21-22]。CRY2在藍(lán)光下與互作蛋白CIB結(jié)合促進(jìn)開花,雙突變體開花要晚于野生型[23]。CRY1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中來回穿梭[24], CRY2在細(xì)胞核中行使功能[25], 而CRY3則主要作為光受體和單鏈DNA修復(fù)酶在線粒體和葉綠體中發(fā)揮作用[26]。番茄的隱花色素基因和能促進(jìn)葉片中花青素苷和葉綠素的積累、促進(jìn)腋分枝、縮短節(jié)間、延遲開花、促進(jìn)果實中類黃酮和番茄紅素的積累[2-3,11]。玉米隱花色素至少存在4個拷貝, 即、、和[27]。玉米基因在白光、紅光、藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光等條件下的轉(zhuǎn)錄豐度存在明顯差異,基因?qū)Ω鞣N光質(zhì)的響應(yīng)則比較相似, 暗示著和存在功能上的分工, 可能參與玉米在紅光和遠(yuǎn)紅光下的光形態(tài)建成的調(diào)控[27]。

迄今, 雙子葉模式生物擬南芥中隱花色素的研究已較為深入, 而玉米、水稻、馬鈴薯、小麥等禾本科單子葉作物中隱花色素的研究僅略有涉及, 對于隱花色素是否參與玉米的光形態(tài)建成以及是否調(diào)控玉米的光溫反應(yīng)也不清楚。通過比較玉米Z和基因響應(yīng)不同光質(zhì)及光周期處理的表達(dá)模式, 了解二者在不同條件下的表達(dá)差異, 比較二者響應(yīng)光的能力, 可進(jìn)一步豐富植物隱花色素基因的研究, 并可為作物的開花期、避蔭性、株高、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀的改良提供指導(dǎo)意見。因此, 研究玉米和基因在不同光質(zhì)及光周期處理下的表達(dá)模式對于了解玉米對光質(zhì)及光周期的敏感性、開花機(jī)理及玉米的引種和高產(chǎn)栽培都具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

1.1.1 試驗材料 以玉米自交系B73的種子為試驗材料(B73材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李新海博士贈予)。以上材料適時取樣，迅速置于液氮凍存，–80℃保藏備用。

1.1.2 組織特異性表達(dá)樣品的準(zhǔn)備 將B73的種子播種于自然條件下一定階段后, 分別取幼苗的根、莖、葉、葉枕、葉鞘、花絲、花柄、雄花、苞葉和幼穗等部位為材料。

1.1.3 各種持續(xù)光質(zhì)處理 將B73的種子放在28℃, 黑暗(Dk)、藍(lán)光(B, 13 μmol m?2s?1)、白光(W, 17 μmol m–2s–1)、紅光(R, 22.3 μmol m–2s–1)和遠(yuǎn)紅光(FR, 0.25 μmol m–2s–1)等培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)13 d。取幼苗地上部為材料。

1.1.4 黑暗轉(zhuǎn)換其他光質(zhì)處理 將B73的種子放在28℃、黑暗中生長13 d。一批分別轉(zhuǎn)入白光(W, 17 μmol m–2s–1)、紅光(R, 22.3 μmol m–2s–11)以及藍(lán)光(B, 13 μmol m–2s–1)等光質(zhì)條件下, 并分別于0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h時對幼苗地上部分取樣。另一批轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)紅光(FR, 0.25 μmol m–2s–1)條件下并于0.16 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和24.08 h時對幼苗地上部取樣。

1.1.5 長日照以及短日照處理 將B73種子分別放在28℃, 長日照培養(yǎng)箱(LD, 16 h光照/8 h黑暗)或者短日照培養(yǎng)箱(SD, 8 h光照/16 h黑暗)等條件下生長13 d, 每2 h取一次樣, 光照和黑暗互相轉(zhuǎn)換時, 在每個取樣節(jié)點前5 min對幼苗地上部取樣。

1.2 酶、試劑和載體

使用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的PrimeSTAR HS酶和DNase I (RNase-free)酶, Invitrogen (USA)公司生產(chǎn)的TRIzol; Thermo Scientific公司生產(chǎn)的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit; TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的定量PCR試劑SYBR Premix ExII, 北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的pEASY-Blunt-Simple載體。

1.3 RNA提取及cDNA合成

用TRIzol法提取各種處理條件下的玉米B73幼苗的總RNA, 用DNase I酶處理并以此為模板, 利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit并以O(shè)ligo-dT18引物將其反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA, 保存于-80℃冰箱備用。

1.4 ZmCRY1b和ZmCRY2基因的克隆

于NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找(ZM02G13620)和(ZM09G 09240)序列并設(shè)計引物(表1), 以黑暗條件下生長13 d的B73幼苗的cDNA為模板, 經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接pEASY-Blunt-Simple載體, 經(jīng)過菌落PCR和雙酶切鑒定后, 交北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。PCR程序為94℃ 5 min; 98℃ 10 s, 58℃ 15 s, 72℃ 2 min, 25個循環(huán); 72℃ 10 min。

1.5 玉米實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析

以不同處理條件下的玉米自交系B73的cDNA第1鏈為模板, 玉米基因為內(nèi)參基因, 用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計RT-PCR引物(表2)。使用Roche 480熒光定量PCR儀, PCR程序為95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 20 s, 72℃ 10 s, 50個循環(huán); 60~95℃繪制溶解曲線。采用的定量PCR試劑為SYBR Premix ExII, 用2–ΔΔCT的方法計算實驗結(jié)果[28], 經(jīng)過3次獨立的生物學(xué)重復(fù)后, 計算其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 ZmCRY1b和ZmCRY2蛋白的序列比對、結(jié)構(gòu)域分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)推導(dǎo)CRY蛋白的氨基酸序列; ProtParam網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam)分析蛋白的分子量、分子式和等電點等性質(zhì); DNAMAN (Version 8)對其進(jìn)行系列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析; SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCRY蛋白和禾本科其他植物CRY蛋白有相同的結(jié)構(gòu)域和較高的同源性

通過RT-PCR方法得到和基因的全長cDNA序列, 其ORF分別含有2067和1965個核苷酸殘基, 編碼蛋白質(zhì)的分子式分別為C3464H5295N997O1009S18和C3316H5116N894O990S28, 分別含有688個和654個氨基酸殘基, 蛋白質(zhì)分子量分別為77.6 kD和74.2 kD, 等電點分別為5.89和5.54。

表1 基因克隆所用引物

表2 qRT-PCR所用引物

利用NCBI網(wǎng)站和SMART網(wǎng)站對擬南芥及小麥、水稻和玉米的CRY蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), 四者的CRY1蛋白都包含一個位于N端的PHR (Photolyase Homologous Region)結(jié)構(gòu)域(由1個DNA photolyase結(jié)構(gòu)域以及1個FAD binding 7 結(jié)構(gòu)域組成)和1個位于C端的CCE (Cryptochrome C-terminal Extension)結(jié)構(gòu)域(圖1); 而CRY2蛋白則僅包含1個PHR結(jié)構(gòu)域(圖2)。玉米CRY1和CRY2蛋白結(jié)構(gòu)域的不同暗示著其功能有異。用NCBI網(wǎng)站獲得模式植物擬南芥()、玉米(L.)、小麥()、水稻(L.)、大豆()、番茄()等植物的CRY蛋白序列, 用DNAMAN進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), ZmCRY1b蛋白與擬南芥、小麥和水稻CRY1蛋白序列的一致性分別為58.6%、72.3%和82.9%; ZmCRY2蛋白與擬南芥、小麥和水稻CRY2蛋白序列的一致性分別為50.2%、73.5%和73.7% (圖3)。說明ZmCRY蛋白與禾本科其他植物的一致性更高, 預(yù)示它們有更相似的功能。

2.2 ZmCRY1b和ZmCRY2器官特異性表達(dá)分析

基因的表達(dá)具有時空特異性, 為研究隱花色素基因在玉米生長和發(fā)育過程中的作用, 我們通過qRT-PCR的方法分析了和兩個基因在玉米的根、莖、葉、葉枕、葉鞘、花絲、花柄、雄花、苞葉、幼穗等器官中表達(dá)豐度的差異。將基因在根中的表達(dá)豐度設(shè)為1, 并以此為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在花絲、幼穗、花柄和雄花和中的表達(dá)量較低(為根部豐度的0.1~0.4倍,<0.01), 在莖和苞葉中表達(dá)豐度與其根中的表達(dá)豐度相似(1.3~1.9倍), 在葉枕和葉鞘中表達(dá)豐度稍高(根中表達(dá)量的2.5~3.2倍, 差異極顯著), 而在葉片中的表達(dá)豐度達(dá)到最大值, 是根中表達(dá)量的31.3倍(圖4)。基因在幼穗和苞葉中的表達(dá)豐度也比較高(1.1~1.4倍), 且葉片中表達(dá)豐度最高(達(dá)到根中的10.4倍,<0.01), 而在其他器官中的表達(dá)豐度僅為根中的0.3~0.9倍, 具有顯著差異(圖4)。說明葉片是和基因在玉米中的主要作用部位, 且的表達(dá)豐度普遍高于, 暗示著在玉米中起著更重要的作用。

圖1 玉米與擬南芥、小麥和水稻的CRY1蛋白等常見作物的氨基酸序列比對及結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI網(wǎng)站和DNAMAN對其進(jìn)行序列比對; 使用SMART網(wǎng)站對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。AtCRY1: 擬南芥CRY1, AAB28724; OsCRY1a: 水稻CRY1a, BAB70686; OsCRY1b: 水稻CRY1b, BAB70688; TaCRY1a: 小麥CRY1a, ABX58028; ZmCRY1b: 玉米CRY1b, ZM02G13620。圖中黑色、深灰色、淺灰色及白色分別代表一致性為100%、75%、50%和0。

Multiple sequence alignments at amino acid levels were analyzed by NCBI and DNAMAN, and the function domains were analyzed by SMART. AtCRY1:CRY1, AAB28724; OsCRY1a:CRY1a, BAB70686; OsCRY1b:CRY1b, BAB70686; TaCRY1a:CRY1a, ABX58028; ZmCRY1b:CRY1b, ZM02G13620. Black, dark grey, light grey, and white in the picture stand for 100%, 75%, 50%, and 0 of consistency, respectively.

圖2 玉米與擬南芥、小麥、水稻等常見作物的CRY2蛋白的氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI網(wǎng)站和DNAMAN對其進(jìn)行序列比對; 使用SMART網(wǎng)站對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。AtCRY2: 擬南芥CRY2, AT1G04400.2; OsCRY2: 水稻CRY2, CAC82538.1; TaCRY2: 小麥CRY2, ABX58030.1; ZmCRY2: 玉米CRY2, ZM09G09240。圖中黑色、深灰色、淺灰色及白色分別代表一致性為100%、75%、50%和0。

Multiple sequence alignments at amino acid levels were analyzed by NCBI and DNAMAN, and the function domains were analyzed by SMART. AtCRY2:CRY2, AT1G04400.2; OsCRY2:CRY2, CAC82538.1; TaCRY2:CRY2, ABX58030.1; ZmCRY2:CRY2, ZM09G09240. Black, dark grey, light grey, and white in the picture stand for 100%, 75%, 50%, and 0 of consistency, respectively.

圖3 玉米與擬南芥、小麥和水稻等常見作物的CRY蛋白在氨基酸水平的系統(tǒng)發(fā)育分析

使用NCBI網(wǎng)站獲得全長氨基酸系列, 使用DNAMAN對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。AtCRY1: 擬南芥, AAB28724; AtCRY2: 擬南芥, AT1G04400.2; BnCRY1: 甘藍(lán)型油菜, CAG28805; BnCRY2a: 甘藍(lán)型油菜, AEA29690.1; BnCRY2b: 甘藍(lán)型油菜油菜, AEA29691.1; GmCRY1a: 大豆, DQ401046; GmCRY1b1: 大豆, AB498929; GmCRY1b2: 大豆, AB498930; GmCRY2: 大豆, XP_006588364.1; OsCRY1a: 水稻, BAB70686; OsCRY1b: 水稻, BAB70688; OsCRY2: 水稻CAC82538.1; HvCRY1a: 大麥, ABB13328; HvCRY1b: 大麥, ABB13331; TaCRY1a: 小麥, ABX58028; TaCRY2: 小麥, ABX58030.1; PsCRY1: 豌豆, AAS79662; SbCRY2: 高粱, AAN37909; SlCRY1a: 番茄, AAD44161; SlCRY1b: 番茄, AAL02092; ZmCRY1a1: 玉米, ZM05G31560; ZmCRY1a2: 玉米, ZM04G17060; ZmCRY1b: 玉米, ZM02G13620; ZmCRY2: 玉米, ZM09G09240。

The amino acid sequences were obtained from the NCBI and the neighbor-joining tree was constructed by the DNAMAN. AtCRY1;CRY1, AAB28724; AtCRY2:CRY2, AT1G04400.2; BnCRY1:CRY1, CAG28805; BnCRY2a:CRY2a, AEA29690.1; BnCRY2b:CRY2b, AEA29691.1; GmCRY1a:CRY1a, DQ401046; GmCRY1b1:CRY1b1, AB498929; GmCRY1b2:CRY1b2, AB498930; GmCRY2:CRY2, XP_006588364.1; OsCRY1a:Group CRY1a, BAB70686; OsCRY1b:Group CRY1bBAB70688; OsCRY2:Group CRY2, CAC82538.1; HvCRY1a:subspCRY1a, ABB13328; HvCRY1b:subspCRY1b, ABB13331; TaCRY1a:CRY1a, ABX58028; TaCRY2:CRY2, ABX58030.1; PsCRY1:CRY1, AAS79662; SbCRY2:CRY2, AAN37909; SlCRY1a:CRY1a, AAD44161; SlCRY1b:CRY1b, AAL02092; ZmCRY1a1:CRY1a1, ZM05G31560; ZmCRY1a2:CRY1a2, ZM04G17060; ZmCRY1b:CRY1b, ZM02G13620; ZmCRY2:CRY2, ZM09G09240.

圖4 ZmCRY1b和ZmCRY2基因在不同器官中的相對表達(dá)水平分析

分別取于自然條件下生長一定階段的B73幼苗的不同器官(根、莖、葉、雄花、葉枕、葉鞘、花絲、幼穗、花柄和苞葉)為材料用于qRT-PCR分析。以根中的的轉(zhuǎn)錄豐度為對照, 將該的比值設(shè)為1。柱狀圖顯示了在3次獨立的生物學(xué)重復(fù)下比值的平均值, 其中, 誤差線代表了標(biāo)準(zhǔn)差。用星號表示差異的顯著性, *< 0.05, **< 0.01。

Different tissues of maize inbred line B73, including root, stem, leaf, stamen, pulvinus, sheath, pedicel, young ear, pistil and bract, were harvested for qRT-PCR assays. The transcription abundance ofin the root was set as the control, and the ratio ofin the root was set as 1. Each column shows the mean expression ofof three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation. *< 0.05, **< 0.01.

2.3 ZmCRY1b和ZmCRY2基因轉(zhuǎn)錄豐度對不同持續(xù)光質(zhì)處理的響應(yīng)

為比較和對各種光質(zhì)響應(yīng)的差異, 采用qRT-PCR的方法分析了玉米B73幼苗在黑暗(Dk)和持續(xù)遠(yuǎn)紅光(FR)、紅光(R)、藍(lán)光(B)、白光(W)等條件下和的表達(dá)豐度。將在黑暗條件下的表達(dá)量設(shè)為1, 并以此為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),和基因?qū)Ω鞣N持續(xù)光質(zhì)均有較強(qiáng)烈的響應(yīng), 尤其是對持續(xù)白光的響應(yīng)最為強(qiáng)烈, 分別為黑暗下基因表達(dá)量的48.0倍和3.7倍(圖5,<0.01)。和基因在持續(xù)的遠(yuǎn)紅光下的表達(dá)豐度也比較高, 分別為黑暗下豐度的29.3倍和2.4倍(差異極顯著)。在藍(lán)光和紅光下,接近自身黑暗下的豐度, 而則為黑暗下的11.9倍和14.7倍(<0.01)。結(jié)果說明玉米和在遠(yuǎn)紅光、紅光、藍(lán)光和白光中均有作用, 而的表達(dá)豐度普遍高于, 暗示在各種持續(xù)光質(zhì)下更重要。

圖5 ZmCRY1b和ZmCRY2基因?qū)憫?yīng)不同光質(zhì)的相對表達(dá)水平分析

米自交系“B73”的幼苗在黑暗、持續(xù)遠(yuǎn)紅光(FR, 0.25 μmol m–2s–1)、持續(xù)紅光(R, 22.3 μmol m–2s–1)、持續(xù)藍(lán)光(B, 13 μmol m–2s–1)或持續(xù)白光(W, 17 μmol m–2s–1)下生長了13 d。以黑暗條件下的的轉(zhuǎn)錄豐度為對照, 并將該的比值設(shè)為1。柱狀圖代表了在3次獨立的生物學(xué)重復(fù)下的平均值, 誤差線代表了標(biāo)準(zhǔn)差。用星號表示差異的顯著性, *< 0.05, **< 0.01。

The seedlings of maize inbred line B73 were grown in continuous far-red light (FR, 0.25 μmol m?2s?1), red light (R, 22.3 μmol m?2s?1), blue light (B, 13 μmol m?2s?1), or white light (W, 170 μmol m?2s?1) for 13 d. The transcription abundance ofin the dark was set as the control, and the ratio ofin the dark was set as 1. Each column shows the mean expression ofof three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation. *< 0.05, **< 0.01.

2.4 ZmCRY1b和ZmCRY2對黑暗到不同光質(zhì)轉(zhuǎn)換的響應(yīng)

將黑暗條件下生長13 d的 B73幼苗依次轉(zhuǎn)入到紅光、藍(lán)光和白光下0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h以及遠(yuǎn)紅光下0.16 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和24.08 h后取材, 用于進(jìn)一步研究和的表達(dá)豐度響應(yīng)不同光質(zhì)的差異。將基因在黑暗條件下的表達(dá)量設(shè)為1, 并以此為對照。

在由黑暗轉(zhuǎn)換到藍(lán)光0.5 h內(nèi),的表達(dá)豐度持續(xù)上升并達(dá)到最大值(為黑暗時的42.9倍)(圖6-A); 隨后在2 h時下降到自身黑暗條件下的水平并保持平緩; 最終在24 h時其轉(zhuǎn)錄豐度又回升至黑暗時的5.4倍。從黑暗轉(zhuǎn)換至藍(lán)光時,基因的表達(dá)模式與比較類似, 只是整體表達(dá)豐度為的12%~55%, 且在由黑暗轉(zhuǎn)到藍(lán)光12~24 h內(nèi),的表達(dá)豐度略有下降, 而平緩上升。在由黑暗轉(zhuǎn)換到藍(lán)光0.5 h內(nèi),的表達(dá)豐度達(dá)到峰值(為自身黑暗時的13倍); 最后在24 h時其豐度又回升到自身黑暗時的2.15倍。結(jié)果表明在由黑暗到藍(lán)光光質(zhì)轉(zhuǎn)換的響應(yīng)中比更強(qiáng)烈。

在由黑暗轉(zhuǎn)換到白光的0.25 h時表達(dá)豐度出現(xiàn)最大峰值(為黑暗時的24.7倍)(圖6-B); 之后在1 h時下降至黑暗時的0.29倍并保持平緩; 在4 h時達(dá)到第2個峰值(為黑暗時的3.4倍); 最終在24 h時其轉(zhuǎn)錄豐度上升至黑暗時的5.3倍。由黑暗轉(zhuǎn)換至白光時,基因的表達(dá)模式與比較類似, 但整體表達(dá)豐度為的20%~55%。在0.25 h時同樣出現(xiàn)最大峰值, 為自身黑暗時的5.9倍; 在1 h 時下降至自身黑暗時的0.18倍; 在4 h時達(dá)到第2個峰值(為自身黑暗時的0.96倍); 在24 h時上升為自身黑暗時的0.9倍(圖6-B)。說明在由黑暗到白光光質(zhì)轉(zhuǎn)換的響應(yīng)中比更強(qiáng)烈。

盡管編碼的是藍(lán)光受體, 但和基因在持續(xù)的遠(yuǎn)紅光和紅光光質(zhì)下也有著相對較高的轉(zhuǎn)錄豐度(圖5), 于是進(jìn)一步檢測了其對紅光和遠(yuǎn)紅光的響應(yīng)(圖6-C和D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在由黑暗轉(zhuǎn)換至紅光時,基因的表達(dá)豐度維持在較低的水平, 并于1 h和4 h時達(dá)到峰值, 分別為黑暗時的4.8倍和14.2倍(圖6-C); 在8 h時下降至2.2倍, 此后開始上升, 并于24 h時達(dá)到黑暗時的58.0倍。在黑暗轉(zhuǎn)換到紅光時表達(dá)模式與較類似, 但整體表達(dá)豐度為的12%~55%。在1 h和4 h時達(dá)到峰值, 分別為自身黑暗時的1.4倍和2.2倍; 在8 h時下降至自身黑暗時的0.6倍, 并于24 h時達(dá)到自身黑暗時的7.4倍。結(jié)果說明在由黑暗到紅光光質(zhì)轉(zhuǎn)換的響應(yīng)中也比更強(qiáng)烈。

在由黑暗轉(zhuǎn)到遠(yuǎn)紅光時,的豐度整體低于, 為其表達(dá)豐度的15%~55% (圖6-D)。在由黑暗轉(zhuǎn)到遠(yuǎn)紅光0.5 h時,的表達(dá)豐度下降至黑暗時的1.8倍; 此后分別于1.5 h、4 h、8 h和24 h時達(dá)到峰值(分別為黑暗時的4.3、8.4、3.0和16.4倍)。的表達(dá)模式與整體類似但略有不同: 在0.25 h時下降至自身黑暗時的0.67倍, 此后開始上升并于1 h時達(dá)到峰值(自身黑暗時的1.7倍); 此后分別于4 h、8 h和24 h時再次達(dá)到峰值(為自身黑暗時的1.3、0.9和1.0倍)。不同之處在于在0.25~0.50 h內(nèi)表達(dá)豐度上升, 在1.0~1.5 h內(nèi)下降, 在2~3 h內(nèi)下降, 這三處與正好相反。結(jié)果表明在黑暗到遠(yuǎn)紅光轉(zhuǎn)換光質(zhì)中比更強(qiáng)烈。

圖6 ZmCRY1b和ZmCRY2基因由黑暗到不同光質(zhì)下的相對表達(dá)豐度

玉米自交系B73的幼苗在黑暗生長13 d后, 分別轉(zhuǎn)入藍(lán)光(B, 13 μmol m–2s–1)、白光(W, 17 μmol m–2s–1)、紅光(R, 22.3 μmol m–2s–1)下0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h以及遠(yuǎn)紅光(FR, 0.25 μmol m–2s–1)下0 h、0.16 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和24.08 h取材, 用于qRT-PCR分析。把黑暗條件下的比值設(shè)為1, 并以此為對照。折線圖代表了在3次獨立的生物學(xué)重復(fù)下的平均值, 其中誤差線代表了標(biāo)準(zhǔn)差。

The seedlings of maize inbred line B73 were grown in the dark for 13 d, then transferred to blue light (B, 13 μmol m?2s?1), white light (W, 17 μmol m?2s?1), or red light (R, 22.3 μmol m?2s?1) for 0.25 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, or 24 h and far-red light (FR, 0.25 μmol m?2s?1) for 0.16 h, 0.25 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, or 24.08 h. The transcription abundance ofin the dark was set as the control, and the ratio ofin the dark was set as 1. Each line graph shows the mean expression ofof three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation.

綜合和基因在不同的持續(xù)光質(zhì)以及由黑暗轉(zhuǎn)換到不同光質(zhì)(白光、藍(lán)光、紅光和遠(yuǎn)紅光)下的表達(dá)豐度可以發(fā)現(xiàn), 二者均能有效地響應(yīng)各種不同光質(zhì)的處理。

2.5 ZmCRY1b和ZmCRY2基因在光周期(長日照和短日照)處理下的表達(dá)水平

為了了解玉米對光周期處理的響應(yīng)能力, 我們采用qRT-PCR分析了和響應(yīng)長日照和短日照處理的表達(dá)模式。將在黑暗階段結(jié)束時的表達(dá)量設(shè)為1, 并以此為對照。

在長日照條件下,和的表達(dá)模式相似, 但整體上的轉(zhuǎn)錄豐度低于, 為的3%~10%。在進(jìn)入光照階段2 h、6 h和14 h時出現(xiàn)了3個峰值(分別為黑暗階段結(jié)束時的78、88和31倍); 在進(jìn)入黑暗階段后, 表達(dá)豐度迅速上升, 且在18 h時達(dá)到峰值(為黑暗階段結(jié)束時的46倍)。則在進(jìn)入光照階段4 h和12 h時出現(xiàn)了峰值(分別為自身黑暗階段結(jié)束時的5.4倍和4.0倍); 在進(jìn)入黑暗階段后, 表達(dá)豐度迅速上升, 且在18 h時達(dá)到峰值(為自身黑暗階段結(jié)束時的4.5倍)(圖7-A)。說明和在由白光轉(zhuǎn)到黑暗時表達(dá)豐度均能迅速上升至較高的水平, 但能更強(qiáng)烈地響應(yīng)長日照處理。

在短日照的條件下,和的表達(dá)出現(xiàn)了極其相似的模式, 二者的轉(zhuǎn)錄水平保持穩(wěn)定的狀態(tài), 但整體上的轉(zhuǎn)錄豐度低于, 為其4%~10%。和在光照階段的峰值均出現(xiàn)在4 h時(此時二者的轉(zhuǎn)錄豐度分別為黑暗階段結(jié)束時的30.2倍和2.7倍)。當(dāng)轉(zhuǎn)入黑暗時, 二者的轉(zhuǎn)錄豐度迅速上升。和分別在轉(zhuǎn)入黑暗階段12 h和16 h時達(dá)到峰值(的轉(zhuǎn)錄豐度分別為在黑暗階段結(jié)束時的71.5倍和94.1倍,則分別為4.4倍和4.3倍)(圖7-B)?？梢姾偷谋磉_(dá)能響應(yīng)長日和短日處理, 且的響應(yīng)能力更強(qiáng)。

圖7 ZmCRY1b和ZmCRY2基因在光周期(長日照和短日照)處理的表達(dá)水平

“B73”的幼苗分別在長日照條件下(LD, 16 h光照/8 h黑暗)或短日照條件下(SD, 8 h光照/16 h黑暗)生長13 d后, 每2 h取一次樣。把在黑暗結(jié)束時期的比值設(shè)為1, 并以此為對照。折線圖代表了在3次獨立的生物學(xué)重復(fù)下的平均值, 其中誤差線代表了標(biāo)準(zhǔn)差。

The seedlings of maize inbred line B73 were grown in long-day condition (LD, 16 h light/8 h dark) or short-day (SD, 8 h light/16 h dark) for 13 d, then sampled every two hours. The transcription abundance ofin the dark was set as the control, and the ratio ofat the end of the dark period was set as 1. Each line graph shows the mean expression ofof three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation.

3 討論

目前對玉米中隱花色素的研究較少且淺顯, 而模式植物擬南芥中的隱花色素研究得較為深入。本研究表明, 玉米與擬南芥及小麥和水稻等禾本科植物的CRY蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域和較高的序列一致性。這暗示著它們可能存在相似的功能, 也為如何深入研究玉米的隱花色素提供了技術(shù)思路。作為藍(lán)光受體,和能夠強(qiáng)烈地響應(yīng)各種持續(xù)光質(zhì)、轉(zhuǎn)換光質(zhì)的處理, 暗示著它們可能參與了白光、藍(lán)光甚至是紅光和遠(yuǎn)紅光下的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外, 二者還能響應(yīng)長日照和短日照的處理, 說明其可能參與光周期誘導(dǎo)的開花。

擬南芥的CRY1和CRY2在藍(lán)光下可抑制下胚軸的伸長并促進(jìn)花蕾的形成, 二者分工不同卻又功能冗余[29]。在藍(lán)光下, CRY1通過與SPA1結(jié)合來抑制COP1/SPA1復(fù)合物的活性, 導(dǎo)致HY5的積累以促進(jìn)光形態(tài)建成并抑制下胚軸的伸長, 而CRY2通過結(jié)合SPA1以抑制COP1/SPA1復(fù)合物的活性, 導(dǎo)致CO蛋白的積累, 或與CIB蛋白結(jié)合以促進(jìn)CO蛋白的積累以及基因的轉(zhuǎn)錄, 從而加速開花[21,23]。CRY不僅促進(jìn)擬南芥的開花, 還能調(diào)控植物品種的緯度分布[9]。近期的研究表明, 除擬南芥[9-10]外, 水稻[13-14]、大豆[18-19]、甘藍(lán)型油菜[20]等植物中的CRY均能促進(jìn)開花。水稻中的OsCRY1介導(dǎo)了藍(lán)光下水稻幼苗的去黃化反應(yīng), 而OsCRY2則促進(jìn)水稻的開花[13-14]。大豆的GmCRY1a和GmCRY2a蛋白與擬南芥的AtCRY1和AtCRY2蛋白序列高度一致, 且均為核蛋白, 但GmCRY1a與AtCRY2的功能類似, 均能促進(jìn)植物開花[18-19]。本研究顯示玉米隱花色素和基因能強(qiáng)烈地響應(yīng)各種光質(zhì)及光周期處理, 推測二者也參與了玉米光形態(tài)建成和開花期的調(diào)控, 但二者對玉米花期的調(diào)控作用及其機(jī)制尚待驗證。

研究表明, 植物中的光敏色素和隱花色素相互作用調(diào)控其光形態(tài)建成及光周期反應(yīng), 進(jìn)而調(diào)控植物的生長和發(fā)育過程[10,30-32]。玉米中隱花色素至少存在4個拷貝, 即、、和, 光敏色素則存在6個拷貝, 即、、、、和。它們之間是否存在互作、互作方式及形成的信號網(wǎng)絡(luò)都值得進(jìn)一步研究。玉米和基因?qū)τ衩组_花是否存在調(diào)控作用及其與開花的調(diào)控基因(、和等)之間的關(guān)系也未被闡明。因此, 玉米和基因?qū)τ衩坠庑螒B(tài)建成和光周期的調(diào)控作用及機(jī)制, 及對玉米的引種和高產(chǎn)的作用也需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

玉米CRY1b蛋白與擬南芥、水稻、小麥等CRY1蛋白的結(jié)構(gòu)相似, 均含有PHR和CCE結(jié)構(gòu)域, 而它們的CRY2蛋白則都含有PHR結(jié)構(gòu)域, 且它們的氨基酸序列一致性較高。和基因在葉片中表達(dá)豐度最高, 能強(qiáng)烈響應(yīng)藍(lán)光、白光、紅光和遠(yuǎn)紅光持續(xù)光質(zhì)及由黑暗到白光、藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光等各種轉(zhuǎn)換光質(zhì)的處理, 并且對長日照和短日照處理也能很強(qiáng)烈地響應(yīng)。結(jié)果暗示和參與玉米光形態(tài)建成及開花調(diào)節(jié), 且在作物改良上比更有效, 其在作物改良中的應(yīng)用價值值得更深入的研究。

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Transcription Abundances ofandGenes in Response to Different Light Treatments in Maize

LI Hong-Dan1,2, YAN Lei1,2, SUN Lei1,2, FAN Xiao-Cong1,3, CHEN Shi-Zhan1,3, ZHANG Yan1,3, GUO Lin1, YOU Guang-Xia1, LI Zhuang1,2, YANG Zong-Ju1,2, SU Liang1,*, and YANGJian-Ping1,3, *

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

Light is lightly related to the important agronomic traits in maize such as plant height, flowering time, yield and quality. Cryptochromes are blue and ultraviolet-A photoreceptors generally existing in animal, plant and microbial, which mainly regulate photomorphogenesis in plants and circadian rhythms in both of plant and animal. Therefore, the expression pattern analysis of cryptochrome in maize could lay a research foundation in the photomorphogenesis in maize. Theandgenes were cloned by RT-PCR. Their proteins’ function domains and the phylogenetic analysis of amino acid sequences were carried out through bioinformatics analysis. The transcription abundances ofandgenes in different tissues of inbred line B73 under different light treatments were analyzed by qRT-PCR. We found that the function domains of ZmCRY1b or ZmCRY2 protein was consistent with CRY1 or CRY2 in, rice and wheat, which contains the PHR and CCE domains or the PHR domain, respectively. Phylogenetic analysis indicated that the three gramineous CRYs from maize, wheat, and rice belonged to the same branch, while showing low similarity to other CRY1 proteins from dicotyledons.andgenes highly expressed in leaf. Meanwhile, they could respond to all treatments of different continuous light conditions, the transitions from the dark to light conditions, as well as long-day and short-day conditions. The transcription abundances ofin all treatments were higher than those of, indicating thatwas more important thanin maize. In conclusion, both ofandgenes can greatly respond to different light conditions and light cycle treatments, and play an important role in maize photomorphogenesis. Our results also provide a research basis for functional exploration ofandin crop improvement.

maize; cryptochrome; photomorphogenesis; light treatment; transcription abundance

2018-01-25;

2018-06-12;

2018-07-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.01290

楊建平, E-mail: yangjianping02@caas.cn, Tel: 010-82105859; 蘇亮, E-mail: suliang_mp5@163.com, Tel: 010-82105851

E-mail: danielle_li2014@163.com, Tel: 010-82105851

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08010002-003-002)，北京市自然科學(xué)基金(重點)項目(6151002)和國家自然科學(xué)基金項目(31570268)資助。

This study was supported by the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation (2016ZX08010002-003-002), the Key Project of Beijing Natural Science Foundation (6151002), and the National Natural Science Foundation of China (31570268).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180629.1608.010.html