左瑞雨，尹清強(qiáng)，常 娟，劉洪兵，王二柱，朱 群

(1.河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;3.泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 463700; 4.河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

黃曲霉毒素是由黃曲霉(Aspergillusflavus)、模式曲霉(Aspergillusnomius)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、B2、G1、G2等共計(jì)20余種，其中以AFB1的毒性最強(qiáng)，具有極強(qiáng)的致畸、致癌和致突變作用，被世界衛(wèi)生組織列為一類致癌物[1-2]。全球每年約有四分之一的谷物因污染霉菌毒素而無法直接飼用或食用，每年由各種霉菌毒素導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元[3]。目前的預(yù)防和監(jiān)測(cè)技術(shù)很難預(yù)測(cè)或者防止霉菌毒素在飼料原料收獲、貯藏和加工過程中的污染，因此，抑制霉菌毒素產(chǎn)生并對(duì)被霉菌毒素污染的糧食作物進(jìn)行有效的脫毒處理，是降低損失、保障人類健康行之有效的方法[4]。從目前市場(chǎng)上銷售的去除霉菌毒素的產(chǎn)品來看，大多采用在飼料中添加蒙脫石、硅鋁酸鹽和活性炭等物理吸附劑來進(jìn)行脫毒處理，其脫毒原理均為霉菌毒素與吸附劑的物理吸附。此類吸附劑在穩(wěn)定的體系中具有一定的去除霉菌毒素的能力，但當(dāng)所在體系的溫度、pH值和離子濃度改變時(shí)，復(fù)合體上吸附的霉菌毒素極易從吸附劑上解離，解離后其毒性依然存在。除此之外，吸附類的脫毒劑對(duì)飼料中的維生素、微量元素等成分也具有一定的吸附作用，降低這些營(yíng)養(yǎng)元素的利用率，嚴(yán)重情況下還會(huì)導(dǎo)致采食此類飼料的畜禽出現(xiàn)各種營(yíng)養(yǎng)缺乏癥[5]。因此，研究效率高、成本低廉的脫毒方法對(duì)發(fā)霉糧食和飼料原料進(jìn)行脫毒成為降低霉菌毒素危害的關(guān)鍵。目前，通過微生物或者微生物發(fā)酵產(chǎn)生的毒素降解酶來處理被霉菌毒素污染的糧食和飼料原料已成為研究的熱點(diǎn)，主要由于其具有脫毒效率高、處理成本低和無有毒有害殘留等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。本研究通過篩選得到具有降解AFB1能力的微生物，并分離純化AFB1降解酶，以期為下一步研發(fā)應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖緩解霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害的產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、氣浴振蕩器、渦旋混合儀、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、酸度計(jì)、磁力攪拌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、水平電泳裝置、凝膠層析裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)、垂直電泳裝置等。

1.1.2 菌種 菌株來源于森林中的腐葉、土壤、靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞便，以及河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存的微生物。

1.1.3 主要試劑 大豆蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鉀、氯化鋇、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、三氯乙酸、硫酸銨、硝酸銨、硫酸鎂、瓊脂粉、考馬斯亮藍(lán)R-250、HCl、Tris等，葡聚糖凝膠Sephadex G-100，透析袋。AFB1由黃曲霉菌(CGMCC 3.4408)固體發(fā)酵后抽提獲得，毒素含量約100 mg/kg。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 初篩培養(yǎng)基 硫酸鎂0.25 g，磷酸二氫鉀0.25 g，硝酸銨1 g，硫酸亞鐵0.001 g，瓊脂17 g，先用蒸餾水溶解，之后調(diào)整pH值至7.0，然后定容至1 L，高壓蒸汽滅菌25 min，取出后置于超凈工作臺(tái)中冷卻至50 ℃左右時(shí)制作固體平板。

1.1.4.2 PDA培養(yǎng)基 酵母2 g，可溶性淀粉6 g，大豆蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO41 g，瓊脂粉15 g，先用蒸餾水溶解，然后再定容至1 L，高壓蒸汽滅菌25 min，取出后置于超凈工作臺(tái)中，冷卻至50 ℃左右時(shí)制作固體平板。

1.1.4.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 麩皮∶豆粕∶玉米(質(zhì)量比)=6∶2∶3，按照固體物料∶蒸餾水=1∶1(質(zhì)量比)的比例加水，混合均勻后按30 g/瓶分裝于250 mL三角瓶中，高壓蒸汽滅菌30 min，取出后置于超凈工作臺(tái)中冷卻后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解AFB1菌株的初篩 將收集的腐葉、土壤、靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞便以及實(shí)驗(yàn)室保存的微生物等用生理鹽水稀釋10～100倍后，取稀釋液100 μL接種于涂布有AFB1的初篩培養(yǎng)基中(AFB1質(zhì)量濃度100 μg/mL)，然后將平板放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以未涂布AFB1的平板作對(duì)照。培養(yǎng)4 d后用滅菌后的接種環(huán)挑取平板中較大的菌落再次接種于涂布AFB1的固體平板中，以菌落的大小和生長(zhǎng)速度作為初篩的依據(jù)。挑取生長(zhǎng)良好的菌株，接種于PDA固體平板，30 ℃培養(yǎng)3 d后保存菌種。

1.2.2 降解AFB1菌株的復(fù)篩

1.2.2.1 降解AFB1真菌降解酶粗酶液的提取 用滅菌后的接種環(huán)挑取2次篩選后生長(zhǎng)良好的真菌孢子以劃線方式接種于PDA平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。向平板中加入含有0.05%的Tween 80(體積分?jǐn)?shù))的滅菌生理鹽水8 mL，用涂布棒小心將孢子刮下，用滅菌過的8層紗布過濾以除去菌絲殘?bào)w，然后將孢子調(diào)整為約1×108cfu/mL，按5 mL/瓶接種于滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，用滅菌玻璃棒攪拌均勻后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，7 d后收獲。按照固體發(fā)酵物∶生理鹽水=1∶2的比例(質(zhì)量比)加入生理鹽水，攪拌均勻后室溫條件下浸泡1 h。將浸泡后的發(fā)酵物用多層紗布過濾，之后10 000 r/min離心5 min，然后分離上清液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?此液體即為粗酶液)。

1.2.2.2 降解AFB1菌株對(duì)AFB1的降解 將粗酶液先用0.20 μm的濾膜過濾除菌，然后取15 mL向其中加入AFB1，使反應(yīng)體系中AFB1的質(zhì)量濃度約為35 μg/L，置于30 ℃氣浴振蕩器恒溫振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測(cè)定AFB1的含量，以甲醇-PBS緩沖液加入同等質(zhì)量濃度的AFB1作為對(duì)照。

1.2.3 AFB1降解酶的分離純化與檢測(cè)

1.2.3.1 AFB1降解酶的鹽析及透析 取含有AFB1降解酶的粗酶液，按517 g/L的量加入硫酸銨，攪拌使其完全溶解后置于4 ℃冰箱8 h，之后3 000 r/min離心10 min，收集離心后的沉淀小心轉(zhuǎn)移至透析袋中，將其懸浮于10 mmol/L Tris-HCl (pH值7.4)的燒杯中進(jìn)行透析，按照30 min/次的頻率更換其中的Tris-HCl溶液，用10%氯化鋇溶液檢查燒杯中硫酸根離子的濃度(用蒸餾水作空白對(duì)照)，待透析后燒杯內(nèi)無沉淀生成時(shí)停止透析，留透析袋內(nèi)液體供下步凝膠層析使用。

1.2.3.2 凝膠層析分離AFB1降解酶 用電子天平稱量10 g Sephadex G-100，小心轉(zhuǎn)移至容量500 mL的燒杯中，加入洗脫液150 mL，室溫條件下溶脹2～3 d，傾瀉多次以去除極細(xì)微粒，然后將溶脹后的凝膠100 ℃水浴處理2 h。將2.5×20 cm的層析柱固定于鐵架臺(tái)上，先注入約8 cm高度的洗脫液，之后將處理好的凝膠貼壁倒入層析柱中，待凝膠沉積2 cm后打開下部閥門，控制流速約為5 mL/10 min。待凝膠沉積高度達(dá)15 cm后停止裝柱，最后用2倍柱床體積的洗脫液平衡凝膠柱，使凝膠層析柱穩(wěn)定。用膠頭滴管將經(jīng)過鹽析和透析處理后的粗酶液緩慢加入凝膠柱頂部，按照3 mL/5 min速度加樣(加樣的同時(shí)即開始收集洗脫液)，保持3 mL/10 min的洗脫速度進(jìn)行洗脫，按照5 min/管的時(shí)間間隔更換收集管收集洗脫液，按順序用阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)。洗脫過程中所用洗脫液體積一般約為凝膠柱體積的6倍以上。

1.2.3.3 AFB1降解酶的SDS-PAGE檢測(cè) 取凝膠層析后不同收集管內(nèi)的AFB1降解酶20 μL與樣品緩沖液按1∶1(體積比)混合，100 ℃水浴處理3 min后立即置于冰浴快速降溫。將處理后的樣品用移液器小心滴入濃縮膠的點(diǎn)樣孔。樣品在濃縮膠時(shí)維持80 V電壓，樣品通過濃縮膠后調(diào)至120 V直至電泳結(jié)束。將凝膠置于5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中室溫條件下振蕩染色過夜，之后取出凝膠將其浸泡于考馬斯亮藍(lán)脫色液中進(jìn)行脫色處理，待凝膠空白區(qū)域洗脫至無色時(shí)拍照保存。

1.2.4 凝膠層析分離AFB1降解酶對(duì)AFB1的降解

選擇SDS-PSGE檢測(cè)后有條帶的收集管內(nèi)的AFB1降解酶各6 mL，加入由黃曲霉菌(CGMCC 3.4408)固體發(fā)酵后抽提獲得的AFB1，使其在體系中的質(zhì)量濃度約為120 μg/L，混勻后置于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h后選用德國(guó)RIDASCREEN公司AFB130/15的96孔酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定剩余的AFB1含量。

1.2.5 AFB1降解菌株的菌種鑒定 首先挑取降解AFB1最高的真菌Y8涂布PDA固體平板，30 ℃培養(yǎng)至有單菌落生長(zhǎng)即停止培養(yǎng)，挑取帶有孢子的菌絲體置于顯微鏡下觀察。將真菌Y8的孢子接種于PDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后經(jīng)多層紗布過濾，取菌絲體，液氮研磨后采用真菌基因組提取法提取Y8的基因組DNA，采用TakaRa Fungi Identification PCR Kit擴(kuò)增目的片段，切膠回收后用Seq Forward作為引物采用26S rDNA ITS(Internal transcribed space)區(qū)序列解析進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行同源序列分析，篩選同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解AFB1菌株的篩選

以AFB1為唯一碳源和能源經(jīng)過2次重復(fù)篩選，共篩選出9株真菌(圖1)，分別編號(hào)為Z4、Y3、Y6、Z8、Z9、Y8、Z5、Y10、Z3。與空白對(duì)照組相比較，9株真菌直接降解AFB1的結(jié)果分別為14.65%、50.01%、36.96%、57.38%、71.75%、77.05%、25.35%、52.48%和43.81%，真菌Y8對(duì)AFB1降解率最高，高達(dá)77.05%。

2.2 AFB1降解酶SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

由圖2可知， 真菌Y8發(fā)酵液凝膠層析過程中從第5管開始有明顯蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)測(cè)量并與蛋白質(zhì)Marker進(jìn)行比對(duì)，第2泳道較明顯的條帶(第6收集管)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為109.4 ku；第3泳道較明顯的條帶(第7收集管)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為80.4 ku；第4、5泳道較明顯的條帶(第8、9收集管)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為31.7 ku，第6、7、8和9泳道較明顯的條帶(第10—13收集管)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為 29.6 ku。

1：蛋白質(zhì)Marker；2—11：凝膠層析過程中第6—15收集管中的洗脫液

2.3 真菌Y8發(fā)酵液凝膠層析后AFB1降解酶對(duì)AFB1的降解結(jié)果

將凝膠層析后將檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量相同的收集管合并為處理組，進(jìn)行AFB1毒素降解試驗(yàn)。由圖3可知，凝膠層析后第8、9收集管蛋白質(zhì)分子量約為31.7 ku，與空白對(duì)照組比較，AFB1降解酶對(duì)AFB1降解率為54.33%。

1：凝膠層析過程中第5—6收集管；2：凝膠層析過程中第7收集管；

2.4 真菌Y8的菌種鑒定結(jié)果

2.4.1 真菌Y8的表型觀察 Y8在PDA平板上生長(zhǎng)迅速， 12 h后即有白色菌絲密布平板，之后黃色孢子快速產(chǎn)生，72 h后孢子顏色逐漸變?yōu)楹稚?圖4)。顯微鏡下觀察帶有孢子的菌絲體，可見真菌Y8的菌絲有隔膜，孢子呈串生，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》[8]相關(guān)圖片，初步判斷真菌Y8為曲霉菌屬。

圖4 真菌Y8表型觀察(5 d)

2.4.2 真菌Y8的ITS區(qū)基因擴(kuò)增及測(cè)序 以真菌Y8的基因組為模板，采用TakaRa Fungi Identification PCR Kit擴(kuò)增真菌Y8的ITS區(qū)，擴(kuò)增出大小約650 bp的條帶(圖5)。

1：DL2000 DNA Marker；2：真菌Y8；

2.4.3 真菌Y8系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果 以Seq Forward為引物采用26S rDNA ITS區(qū)序列解析進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選與真菌Y8同源性較高的26S rDNA序列，運(yùn)用MEGA4軟件計(jì)算序列相似性并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)。結(jié)果顯示，真菌Y8在與同源性較高的序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，與米曲霉(Aspergillusoryzae)屬于同一分支，其同源性達(dá)99%，因此，確定篩選得到的具有降解AFB1作用的真菌Y8為米曲霉。

圖6 基于26S rRNA ITS序列的真菌Y8系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

3.1 降解AFB1微生物的篩選

目標(biāo)微生物的篩選是根據(jù)篩選目的綜合運(yùn)用多種篩選方法，從含有目標(biāo)微生物的樣品中準(zhǔn)確、有效的將目標(biāo)微生物分離的過程。微生物的篩選一般包括樣品的采集、微生物富集培養(yǎng)和菌株分離純化等環(huán)節(jié)。李俊霞等[9]在篩選具有降解AFB1作用的微生物時(shí)，把香豆素作為能源和碳源，分離得到1株具有降解AFB1作用的嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，對(duì)AFB1的降解率達(dá)85.7%。李冰等[10]用實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉直接進(jìn)行AFB1降解試驗(yàn)，結(jié)果顯示，黑曲霉對(duì)AFB1降解率高達(dá)93.28%，對(duì)黑曲霉降解AFB1的活性成分進(jìn)行分離，測(cè)定結(jié)果顯示，其胞外酶對(duì)AFB1的降解能力(84.20%)顯著高于菌體細(xì)胞和胞內(nèi)物質(zhì)。孫豐芹等[11]采用在無碳培養(yǎng)基中添加香豆素的方法,從花生餅和土壤中篩選具有降解AFB1作用的菌株，最終從初篩得到的7株菌中篩選得到的TRS-3菌株，其液體發(fā)酵培養(yǎng)液上清液對(duì)AFB1的降解率達(dá)到78.55%，16S rDNA菌種鑒定結(jié)果顯示，TRS-3菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。關(guān)心[12]用香豆素作為AFB1的替代物篩選出對(duì)AFB1降解作用顯著的菌株F6，降解率高達(dá)83.2%，通過生理生化鑒定初步判定其為芽孢桿菌屬，之后通過16S rRNA菌種鑒定，結(jié)果顯示，其核苷酸序列與蔬菜芽孢桿菌(Bacillusoleronius)的同源性達(dá)99.7%。王燕等[13]用香豆素為唯一碳源和能源篩選得到菌株WZ-4，降解率為75.25%，16S rDNA序列同源性分析顯示其為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophilus)。在參照現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)篩選能夠降解AFB1的菌株，采用AFB1作為唯一能源和碳源的方法進(jìn)行初篩，這樣能夠利用AFB1作為能源和碳源的菌株可正常生長(zhǎng)，而不能利用的菌株生長(zhǎng)則受到抑制，然后通過分離、富集培養(yǎng)，篩選得到對(duì)AFB1降解率高達(dá)77.05%的真菌Y8，真菌26S rDNA菌種鑒定和同源序列分析結(jié)果顯示，具有降解AFB1作用的真菌Y8為米曲霉。與其他報(bào)道中篩選出的降解黃曲霉毒素的菌株相比，本研究篩選的米曲霉可采用固體發(fā)酵的方法生產(chǎn)AFB1降解酶，其產(chǎn)物無需采用載體吸附保護(hù)酶活性，可直接進(jìn)行干燥處理，為下步毒素降解酶的規(guī)?；a(chǎn)及其在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供了便利。

3.2 降解AFB1活性物質(zhì)的分離

酶的分離包括酶蛋白的發(fā)酵、提取、純化、干燥及精制等步驟。酶的抽提常采用離心、鹽析、過濾和萃取等方法，純化過程主要采取層析、過濾和反滲透等措施。凝膠層析是目前應(yīng)用較為廣泛的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，又稱為分子篩、凝膠排阻和凝膠過濾層析等。凝膠層析是以多孔性凝膠為固定相，之后通過洗脫液按照被分離物質(zhì)分子量大小順序使其從混合體系中先后洗脫出來的液相色譜方法，因其處理過程溫和、不改變被分離物質(zhì)的活性，所以被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離及濃縮、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測(cè)定以及核酸、多糖等生物大分子的分離純化。有研究者從假蜜環(huán)菌(Armillariellatabescens)的菌絲體中分離出具有降解AFB1作用的復(fù)合多酶體系，采用硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠層析和離子交換層析從中分離得到對(duì)AFB1具有顯著降解作用的黃曲霉毒素降解酶(Aflatoxin detoxifizyme)，其分子質(zhì)量大小約為51.8 ku，降解AFB1試驗(yàn)結(jié)果顯示，酶的回收率約10%[14-15]。Cao 等[16]對(duì)假蜜環(huán)菌降解AFB1的機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，AFB1毒性的消失是因?yàn)榧倜郗h(huán)菌產(chǎn)生的蛋白酶AFO作用于AFB1的呋喃環(huán)，從而達(dá)到降解AFB1的目的。Teniola等[17]的研究表明，分支桿菌(Mycobacteriumfluoranthenivorans)和紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的液體培養(yǎng)液和菌體胞內(nèi)酶，在30 ℃條件下培養(yǎng)4 h，對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率均在90%以上，8 h后則可完全降解。Motomura等[6]采用色譜柱層析和疏水親和層析相結(jié)合的方法從糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)中分離得到對(duì)AFB1具有顯著降解作用的胞外酶，其分子質(zhì)量為90 ku，對(duì)該酶脫毒條件進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)其在溫度25 ℃、pH 值4～5時(shí)對(duì)AFB1降解率最高。楊文華等[18]對(duì)篩選得到的具有降解AFB1作用的施氏假單胞菌F4(PseudomonasStutzeri)進(jìn)行發(fā)酵，采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose交換柱層析和葡聚糖凝膠Sephadex G-100等方法，分離純化得到24 ku的AFB1降解酶，其回收率約56%。本試驗(yàn)采用硫酸銨分級(jí)沉淀和葡聚糖凝膠Sephadex G-100對(duì)含有AFB1降解酶的粗酶液進(jìn)行分離純化，得到31.7 ku的AFB1降解酶，但經(jīng)硫酸銨沉淀和凝膠層析分離的AFB1降解酶對(duì)AFB1的降解率較粗酶液下降，這可能與粗酶液在鹽析、層析過程中酶活性降低有關(guān)，亦有可能是層析過程中因大量洗脫液的加入導(dǎo)致AFB1降解酶的質(zhì)量濃度降低，同時(shí)未對(duì)凝膠層析后的酶蛋白進(jìn)行濃縮有關(guān)。