陳文燁，焦義然，楊軍峰，劉永偉，楊 帆，董福雙，王海波，杜進(jìn)民，周 碩*

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051； 3.河北旺豐種業(yè)有限公司，河北 邢臺 054900)

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，小麥產(chǎn)量的提高對于保障我國糧食安全具有重要的意義。低溫、干旱和病蟲害等逆境脅迫是造成小麥產(chǎn)量降低的重要因素[1]。其中，土壤鹽漬化作為一種影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要環(huán)境因素，對農(nóng)業(yè)的發(fā)展也存在阻礙作用[2]。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)在植物非生物逆境應(yīng)答和Ca2+信號介導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[3]。CBL蛋白能感受細(xì)胞中Ca2+濃度并能與絲/蘇氨酸蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)互作對下游基因進(jìn)行調(diào)控，從而對逆境脅迫進(jìn)行應(yīng)答反應(yīng)[4-5]。李剛波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，杜梨CBL4基因編碼蛋白由212個氨基酸殘基組成，且與擬南芥CBL4基因親緣關(guān)系最近，推測杜梨CBL4基因可能對Ca2+濃度的感受和傳遞具有調(diào)控作用，以此來進(jìn)行逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。擬南芥CBL4基因與水稻CBL4基因同樣存在較高的同源性，兩者在鹽響應(yīng)信號途徑(Salt overly sensitive，SOS)中具有類似的信號系統(tǒng)，即主要在植物根部調(diào)控耐鹽性[7]。小麥抗干旱、低溫和高鹽脅迫等逆境的研究一直備受關(guān)注，尤其是CBL蛋白在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用已成為研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)。

CBL4基因與其編碼蛋白的關(guān)系是通過三聯(lián)密碼子來建立的。在自然界存在61種密碼子，上述密碼子可編碼成20種氨基酸，這就會產(chǎn)生同義密碼子，即一種或多種密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象[8]，并且每種密碼子的使用頻率存在差異[9-10]，出現(xiàn)頻率較高的密碼子為最優(yōu)密碼子，說明基因存在密碼子偏好性[11]。密碼子偏好性分析不僅可以為植物基因功能和進(jìn)化差異研究提供理論依據(jù)[12]，而且基因表達(dá)水平的高低與其相對同義密碼子使用度(RSCU)密切相關(guān)[13]。因此，研究植物CBL4基因密碼子偏好性，對了解CBL4基因及其基因家族的進(jìn)化規(guī)律、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控及提高基因表達(dá)水平均具有參考價值。但目前還未出現(xiàn)關(guān)于小麥CBL4基因密碼子偏好性的報道。為此，采用CodonW和Usage Codon軟件分析小麥CBL4基因密碼子偏好性，并將其與其他17種不同目植物CBL4基因密碼子偏好性進(jìn)行比較，以期為小麥CBL4基因改良以提高對干旱、低溫和鹽脅迫等逆境的抗性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

小麥及其他17種不同目植物CBL4基因核苷酸序列來源于NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

利用MEGA軟件分析CBL4基因堿基序列分布比例。使用Usage Codon在線軟件(http://www.geneinfinity.org/sms/sms_codonusage.html)計算18種植物CBL4基因的密碼子所占的比例和頻率。使用CodonW軟件計算18種植物CBL4基因的RSCU、ENc(有效密碼子數(shù))、GC(GC含量)、GC3s(密碼子第3位的GC含量)、CBI(密碼子偏愛指數(shù))和FOP(最優(yōu)密碼子使用頻率)、Gravy(蛋白質(zhì)親水性)和Aromo(芳香族氨基酸比例)。通過SPSS軟件分析上述影響密碼子偏好性指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)。利用Bioedit軟件比對不同植物CBL4基因編碼區(qū)核苷酸序列，再由MEGA軟件的最小進(jìn)化法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，該系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性經(jīng)1 000次重復(fù)的自舉檢驗法來檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥等18種植物CBL4基因堿基序列分析

如表1所示，小麥等18種不同目植物CBL4基因核苷酸序列長度不一致，小麥CBL4基因序列全長為657 bp，天門冬最短，全長324 bp，芝麻最長，全長678 bp，兩者相差354 bp，但兩者的堿基占總序列比例變化不大。小麥CBL4基因編碼區(qū)核苷酸序列中T所占比例最小，G和C所占比例較大，G+C所占比例達(dá)58.0%。馬鈴薯與小麥相反，主要由A和T組成，A+T所占比例達(dá)66.2%，高于其他17種植物，除小麥外的其他16種植物的堿基占比情況與馬鈴薯類似。小麥CBL4基因的ENc低于其他17種植物，而蘿卜的ENc最高；小麥的GC、GC3s、FOP和CBI均高于其他17種植物，而馬鈴薯的GC和GC3s均最低，香瓜的FOP和CBI均最低。小麥的G+C所占比例達(dá)58.0%，其中以第3位GC含量為主，提示GC含量對小麥CBL4基因密碼子偏好性具有重要的影響，而馬鈴薯與小麥形成鮮明的對比。

2.2 小麥CBL4基因密碼子偏好性分析

小麥CBL4基因共由219個密碼子組成，如表2所示，小麥CBL4基因偏好使用的密碼子依次是CUC、AGG、UAA、AUC、GUG、GCG、ACG、UGC和GGC，上述密碼子的RSCU≥2。其中，終止密碼子是UAA；而CUA、GUU、CUA、UCU、CCA、ACU、GCU、UGU、CGU、CGA、AGA、GGU、UAG和UGA這14個密碼子的RSCU為0，表明小麥CBL4基因在蛋白質(zhì)合成過程中對密碼子的使用具有明顯的偏好性。

表1 CBL4基因編碼區(qū)堿基分布比例和部分偏性指標(biāo)

表2 Usage Codon和CodonW程序分析小麥CBL4基因的密碼子偏好性

注：標(biāo)下劃線處為大于1.5的RSCU，下同。

2.3 除小麥外的17種植物CBL4基因密碼子使用偏性指標(biāo)及其影響因素

除小麥外的17種不同植物CBL4基因的RSCU如表3所示，多數(shù)植物對UUG、CUU、AUU、GUU、CCU、CCA、ACU、ACA、GCA、UAU、AGA、AGG密碼子的使用具有較強(qiáng)的偏好性。對于終止密碼子，不同植物的使用頻率不同。不同植物CBL4基因密碼子偏好性影響因素分析如表4所示，其中GC3s和GC均與CBI呈極顯著正相關(guān)，而Gravy和Aromo均與CBI呈負(fù)相關(guān)，但不顯著；ENc與GC3s、GC、Aromo均呈負(fù)相關(guān)，與Gravy呈正相關(guān)，但均不顯著。結(jié)果顯示,GC3s和GC是引起不同植物CBL4基因密碼子偏好性的主要因素，Gravy和Aromo對其密碼子使用有一定的影響，但不是主要因素。

表3 17種植物CBL4基因的RSCU

續(xù)表3 17種植物CBL4基因的RSCU

表4 偏性指標(biāo)與影響因素的相關(guān)系數(shù)

注:**表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。

2.4 小麥等18種植物CBL4基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

對18種不同植物CBL4基因的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖1所示，小麥與向日葵之間的親緣關(guān)系最近，但兩者與其他16種植物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與小麥密碼子使用特征差異最大的馬鈴薯與香瓜親緣關(guān)系最近，而香瓜的FOP和CBI與小麥相差最大，說明密碼子偏好性結(jié)果與聚類分析得出的親緣關(guān)系結(jié)果一致。

圖1 小麥等18種植物CBL4基因編碼區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

目前，對植物CBL蛋白的研究已經(jīng)從擬南芥這種模式生物發(fā)展到糧食作物、蔬菜和果樹等植物[14-19]。植物CBL基因在生物、非生物逆境應(yīng)答和脫落酸(Abscisic acid，ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中均發(fā)揮重要作用[20]。模式生物擬南芥CBL1、CBL2、CBL3、CBL4和CBL9基因均參與低鉀信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[21]。劉明毓等[22]推測,甜瓜CBL4基因參與鹽、冷、干旱等脅迫應(yīng)答和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。余義和等[23]發(fā)現(xiàn)，葡萄CBL4基因啟動子活性在干旱、低溫和鹽脅迫處理后顯著提高，且其轉(zhuǎn)錄本在這些脅迫處理后也能快速響應(yīng)。董鳳麗等[24]發(fā)現(xiàn)，甘菊CBL4基因可能也參與鹽、干旱等逆境脅迫的應(yīng)答。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同植物CBL4基因核苷酸序列長度存在差異，小麥CBL4基因含有657個堿基，編碼219個氨基酸，其中CUC、AGG、UAA、AUC、GUG、GCG、ACG、UGC和GGC密碼子為其最優(yōu)密碼子，CUA、GUU、CUA、UCU、CCA、ACU、GCU、UGU、CGU、CGA、AGA、GGU、UAG和UGA密碼子的使用頻率為0，說明小麥?zhǔn)且环N極其偏愛使用G/C結(jié)尾密碼子的植物，不偏愛使用A/U結(jié)尾的密碼子。小麥CBL4基因的終止密碼子為UAA(TAA)，有研究表明，使用TAA作為終止密碼子的生物多為低復(fù)雜度的真核生物(如酵母、非脊柱動物)，而使用TAG作為終止密碼子的生物也較少，使用TGA作為終止密碼子的生物主要是脊柱動物[25]。但植物CBL4基因所使用的終止密碼子不均是TAA，TAG和TGA終止密碼子的使用也較多，且無規(guī)律性，這可能與其堿基長度有關(guān)。

對小麥CBL4基因密碼子偏性指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其ENc在18種植物中最低，但GC、GC3s、FOP和CBI均最高，與小麥不同的是，蘿卜的ENc最高，馬鈴薯的GC和GC3s最低，香瓜的FOP和CBI均最低，模式生物擬南芥的密碼子使用特征最接近蘿卜。有研究表明，擬南芥CBL4基因與玉米和番茄CBL4基因同源[26]，都存在類似的耐鹽性特征[27]。本研究的密碼子偏好性結(jié)果與聚類分析得出的親緣關(guān)系結(jié)果一致，即與小麥密碼子使用特征差異最大的馬鈴薯與香瓜親緣關(guān)系最近，表明密碼子偏好性結(jié)果有利于揭示植物CBL4基因的進(jìn)化規(guī)律。小麥等植物CBL4基因密碼子使用偏好性的揭示，可以為選擇最優(yōu)密碼子來對抗干旱、低溫和鹽脅迫等逆境，以及人工合成基因序列提高目標(biāo)蛋白表達(dá)水平等提供理論依據(jù)。