田嘉瑩， 盛寶英， 韓 鳳， 姜堯佳， 李叢言， 畢 勝

急性腦梗死是目前致殘率、病死率最高的疾病之一，因其易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點引起了人們的重視[1]。急性腦梗死后可引起缺血中心區(qū)和周圍區(qū)神經(jīng)元損傷，其致病機制之一是全身炎癥反應(yīng)綜合征。然而需要特殊強調(diào)的是腦內(nèi)的強炎性反應(yīng)引起腦組織病灶區(qū)的損傷比缺血本身更嚴(yán)重[2]。因此，恢復(fù)及保持腦梗死后機體免疫系統(tǒng)功能的正常對腦梗死患者具有重要的臨床意義。

輔助性T細胞17( T helper 17 cells,Th17)是最近新發(fā)現(xiàn)的一群獨特的CD4+輔助性T細胞亞群。相關(guān)研究認為，炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中Th17細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，急性腦梗死患者缺血部位Th17浸潤、活化后可有效透過血-腦脊液屏障、高表達顆粒酶 B、導(dǎo)致神經(jīng)元損傷并分泌多種細胞因子，參與自身免疫應(yīng)答[3]。本實驗通過觀察Th17及其效應(yīng)分子的動態(tài)變化，確定其在急性腦梗死發(fā)生發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)作用。以期為急性腦梗死后炎癥反應(yīng)的有效控制降低腦損傷程度提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 BCA蛋白定量試劑盒(BOSTER，Prod：AR0146)，兔源β-Actin 單克隆抗體(Cell signaling，13E5)，兔源NF-κB P-65多克隆體抗(Affinity，AF5006)，兔源p-P38 單克隆抗體(Cell signaling，D3F9)。

1.2 急性腦梗死大鼠模型構(gòu)建 按照常規(guī)方法-線栓法[4]通過手術(shù)制備大腦中動脈閉塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為300 mg/kg。頸部正中縱行切開，暴露左側(cè)頸總和頸外動脈，分離迷走神經(jīng)以防損傷。阻斷頸總動脈的近心端下微血管血流后，在頸外動脈遠心端和近心端之間插入普通尼龍線栓，使一側(cè)大腦中動脈閉塞。120 min后拔出線栓，縫合、消毒。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，隨即縫合切口。

1.3 實驗動物及分組 8～10周齡的雄性SD大鼠，體重250～300 g，共20只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。隨機分為3組，MCAO 24 h、72 h和假手術(shù)組，5只/組。

1.4 模型評價 模型制備后24 h，動物應(yīng)清醒。隨即采用Bederon[4]等的方法通過神經(jīng)功能評分確定模型是否構(gòu)建成功。 計分方法如下：(1)提大鼠尾巴，觀察右前肢內(nèi)收、內(nèi)旋情況，根據(jù)輕重程度，評分為1～3分。4分：大鼠身體右側(cè)旋轉(zhuǎn)。(2)大鼠肌張力評定：借助金屬網(wǎng)，通過向后輕拉大鼠尾巴觀察雙側(cè)前肢肌張力，根據(jù)輕重程度，評分為0～2分。(3)借助光滑平面，觀察側(cè)向推擋阻力。0分：兩側(cè)推無顯著差別;1分：右側(cè)明顯弱于左側(cè);2分：向右推大鼠向右側(cè)傾倒。(4)大鼠左上眼瞼下垂且分泌物增多，評為2分?？偡?0分。以上評分相加為最后得分，大于3分屬于造模成功，低于3分直接剔除。

1.5 外周血Th17細胞數(shù)量的檢測 制備流式細胞儀樣品，三色標(biāo)記Th17細胞：抗CD3-FITC單克隆抗體、抗CD4-PE單克隆抗體和抗IL-17A-APC單克隆抗體，另設(shè)陰性對照管。流式細胞儀專用染色管中加入EDTA抗凝血0.1 ml，紅細胞裂解液裂解3次，3%FCS洗滌3次后加入CD3-FITC單克隆抗體、抗CD4-PE單克隆抗體抗體孵育30 min進行表面染色，3%FCS洗滌后加入固定透膜劑孵育，隨后加入抗IL-17A-APC熒光抗體進行細胞內(nèi)染色。流式細胞儀(FACSCalibur，美國B&D公司)檢測，應(yīng)用FACSCELLQUEST軟件，每個樣品分析10000個細胞，以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點陣圖顯示，記錄Th17細胞的百分率。

1.6 Western blotting檢測大鼠腦組織中NF-κB P65和p-P38表達水平 動物脫臼處死，取出大腦，冰凍的PBS清洗組織表面血液，取梗死部位大腦組織，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加蛋白裂解液均漿后BCA法測蛋白濃度，上清液-80 ℃保存。適量蛋白上樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)后5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加NF-κB p65 (1∶1000)、p- P38(1∶1000) 和β-actin抗體，4 ℃ 孵育過夜，室溫下HRP標(biāo)記的二抗(1∶10000)孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。采用 Image-J圖像分析軟件，計算各指標(biāo)相對于內(nèi)參的相對吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠外周血中Th17細胞數(shù)量變化 與假手術(shù)組(Sham)相比，急性腦梗死大鼠出血24 h(MCAO 24 h)和72 h(MCAO 72 h)組外周血中Th17細胞數(shù)量均明顯增加(P<0.01)；與MCAO 24 h組相比，MCAO 72 h組外周血中Th17細胞數(shù)量增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

2.2 大鼠腦組織中NF-κB P65蛋白表達變化 與Sham組相比，MCAO 24 h和72 h組腦組織中NF-κB P65蛋白表達明顯增加(P<0.01)；但是腦梗死后的時間并沒有明顯影響腦組織中NF-κB P65蛋白的表達(P<0.05)(見圖2)。

2.3 大鼠腦組織中p-P38蛋白表達變化 與Sham組相比，MCAO 24 h和72 h組腦組織中p-P38蛋白表達明顯增加(P<0.05，P<0.0,1)；但是腦梗死后的時間并沒有明顯影響腦組織中p-P38蛋白的表達(P<0.05)(見圖3)。

與Sham組比較**P<0.01; 與MCAO 24 h組比較#P< 0.05

圖1 急性腦梗死大鼠外周血中Th17細胞數(shù)量變化

與Sham組比較**P< 0.01

圖2 急性腦梗死大鼠腦組織中NF-κB P65蛋白表達變化

與Sham組比較*P< 0.05，**P< 0.01

圖3 急性腦梗死大鼠腦組織中p-P38蛋白表達變化

3 討 論

感染并發(fā)癥在腦梗死患者中的發(fā)生率約為21%～65%[5,6]，是腦組織損傷的主要誘因，與腦梗死患者的臨床結(jié)局和長期預(yù)后密切相關(guān)[7]。然而，關(guān)于腦梗死后機體如何發(fā)揮抗感染免疫調(diào)節(jié)機制，迄今為止仍然存在大量未知領(lǐng)域。相關(guān)研究表明，CD4+T細胞亞群之間的相互作用是免疫調(diào)節(jié)平衡作用的關(guān)鍵因素之一。CD4+T細胞的免疫失調(diào)在急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。然而，Th17作為致炎性細胞因子IL-17的主要來源，是否參與了急性腦梗死后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的繼發(fā)性腦水腫和腦損害，目前尚無定論。

相關(guān)研究證明，Th17可能參與了頸動脈粥樣硬化的發(fā)生/發(fā)展，腦梗死患者外周血的Th17比例及IL-17水平越高，頸動脈斑塊越大[8]。然而動脈粥樣硬化是急性腦梗死發(fā)生的主要原因。Shichita等研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)生后出血周圍的腦組織中大量T細胞浸潤，并且腦組織的損傷及神經(jīng)功能的缺失與IL-17和IL-23水平升高密切相關(guān)[9]。由此可見，Th17不僅參與了急性腦梗死的發(fā)生，而且在急性腦梗死后繼發(fā)性腦水腫和腦損傷的病理過程中也占有重要一席。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，急性腦梗死大鼠外周血中Th17細胞數(shù)量明顯增加，并與出血時間呈正相關(guān)(見圖1)。相關(guān)文獻報道，腦出血后血腫周圍組織在發(fā)病24～72 h炎癥反應(yīng)及組織損傷最為嚴(yán)重。與本實驗結(jié)果相一致，Th17在外周血中的增加與腦組織炎癥反應(yīng)及損傷時間上一致，進一步證實急性腦梗死后Th17參與了腦組織的炎癥反應(yīng)。Th17細胞及其分泌的細胞因子在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮重要作用。IL-17作為Th17的特征性/效應(yīng)性細胞因子，與受體結(jié)合后通過活化MAPK(絲裂原而活化蛋白激酶)和NF-κB(核因子κB)激活多種免疫細胞(包括樹突狀細胞、單核細胞、成纖維細胞)，尤其是中性粒細胞，誘導(dǎo)多種促炎性因子調(diào)控固有和特異性免疫應(yīng)答引起組織炎性細胞浸潤并導(dǎo)致組織破壞[10]。為了明確Th17是如何參與急性腦梗死大鼠腦部免疫細胞的活化和誘導(dǎo)，在本實驗中檢測了p-P38和NF-κB P65蛋白的表達。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白的表達趨勢與Th17在外周血中的百分比完全一致。由此證明Th17細胞可通過調(diào)控NF-κB和P38的活化調(diào)控急性腦梗死大鼠腦部炎癥反應(yīng)。

卒中后的免疫炎性反應(yīng)對機體來說是一把雙刃劍。根據(jù)卒中后缺血發(fā)生的時間長短、免疫細胞的種類和數(shù)量或者小膠質(zhì)細胞的活化程度等來評定免疫細胞是發(fā)揮損傷性作用還是保護性作用[11]。因此我們發(fā)現(xiàn)，如果腦梗死發(fā)生后的免疫炎性反應(yīng)能夠進行人為調(diào)控，誘導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)適度從而對機體產(chǎn)生保護性作用，達到操控腦梗死的臨床過程和預(yù)后。本實驗發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死后發(fā)生的炎性反應(yīng)與Th17細胞密切相關(guān)，因此臨床上可以通過調(diào)控IL-17的水平改善卒中后的炎性反應(yīng)，為其后發(fā)生的腦水腫和腦損傷提供新的治療途徑。