秦 川， 樊文慧， 劉 倩， 張 強(qiáng)

腦血管疾病是世界上第三大死亡原因[1]，具有復(fù)發(fā)率高、致殘率高和死亡率高的“三高特征”。腦血管疾病分為出血性和缺血性腦血管疾病，缺血性疾病占腦血管疾病的60%～80%，眾所周知的是缺血性腦血管疾病會(huì)導(dǎo)致灰質(zhì)損傷，然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血主要引起腦白質(zhì)損害[2]。相對(duì)灰質(zhì)損傷而言，對(duì)白質(zhì)損害的研究在很大程度上處于被忽視的狀態(tài)，所以我們迫切需要開(kāi)始研究治療白質(zhì)損害的方法。缺血性腦白質(zhì)損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，大量研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦白質(zhì)損傷以膠質(zhì)細(xì)胞增生及髓鞘不同程度脫失為基本特點(diǎn)[3]。

芬戈莫德(FTY720)是一種口服的免疫抑制劑，美國(guó)食品和藥物管理局于2010年9月準(zhǔn)許此藥作為治療多發(fā)性硬化的一線(xiàn)藥物[4]。在多發(fā)性硬化動(dòng)物模型中FTY720被證明可通過(guò)促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟及髓鞘再生而治療多發(fā)性硬化[5]。另外，最近研究表明患者口服FTY720可以治療出血性腦血管病和缺血性腦血管病，輕到中度腦出血患者在72 h內(nèi)口服FTY720可以減弱疾病進(jìn)展、促進(jìn)恢復(fù)[6]，急性缺血性卒中患者在72 h內(nèi)口服FTY720可抑制組織的第2次損傷、減緩疾病的進(jìn)展、促進(jìn)恢復(fù)[7]。研究推測(cè)FTY720治療腦血管疾病的主要機(jī)制是其抗炎作用[6,7]。因此，我們猜想FTY720可能對(duì)低灌注引起的缺血性腦白質(zhì)損傷有保護(hù)作用且這種作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)炎性有關(guān)。鑒于以上猜想，本研究通過(guò)小鼠低灌注腦白質(zhì)損傷模型的建立，研究FTY720對(duì)低灌注腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年的SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，10 w大小，體重(23～25)g，從華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獲得。

1.2 主要試劑及材料 微型彈簧(日本SAWANE彈簧有限公司)，F(xiàn)TY720(美國(guó)Cayman生物公司)，固藍(lán)(LFB)染液(武漢谷歌科技有限公司)，兔抗 Iba-1 單克隆抗體(wako公司)，大鼠抗小鼠CD68多克隆抗體(BD公司)。

1.3 小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄(bilateral common carotid artery stenosis,BCAS)模型建立 小鼠BCAS模型按照前人的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母牧糩8]，步驟簡(jiǎn)述如下：該模型的主要特點(diǎn)是用內(nèi)徑為0.18 mm微型彈簧狹窄頸總動(dòng)脈；小鼠腹腔注射麻醉劑后，將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒、備皮，在頸中線(xiàn)位置切口，使頸總動(dòng)脈暴露出來(lái)，再用兩根4號(hào)線(xiàn)放在頸總動(dòng)脈下方，然后輕輕的將頸總動(dòng)脈提起，將微型彈簧旋轉(zhuǎn)、套扎到頸總動(dòng)脈上，完成一側(cè)后，用同樣的方法狹窄另一側(cè)頸總動(dòng)脈。整個(gè)過(guò)程不應(yīng)超過(guò)10 min，小鼠的溫度維持在36.5 ℃和37.5 ℃之間。

1.4 給藥 于造模后24 h內(nèi)開(kāi)始，治療組給予 0.3 mg/kg 的FTY720腹腔注射，每天一次，連續(xù)3 d，10 d及一個(gè)月。

1.5 Luxol Fast Blue(LFB)染色 用LFB染色觀察腦白質(zhì)區(qū)髓鞘的改變，步驟簡(jiǎn)述如下：取出小鼠冰凍切片后將小鼠腦組織標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定15 min，再梯度(75/95/100%)乙醇脫水，脫水后將冰凍切片放入預(yù)先準(zhǔn)備好的LFB溶液中于60 ℃的烤箱孵化8 h，從LFB溶液中取出切片后用0.05% Li2CO3分色，梯度(75/95/100%)酒精脫水，二甲苯透明15 min，最后中性樹(shù)膠封片。

1.6 免疫熒光染色 小鼠麻醉取腦后快速放入異戊烷中速凍，然后將小鼠大腦用冰凍切片機(jī)冠狀面切成厚度為10 μm的切片，將小鼠腦組織切片以4%多聚甲醛固定15 min后，用0.25% Triton X-100破膜液室溫破膜15 min，再用封閉液(PBS含1%BSA，0.1%Triton)室溫下封閉60 min，加入兔抗小鼠Iba1抗體(1∶200)，大鼠抗小鼠CD68抗體(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，用PBS洗3遍，每遍10 min，之后以相應(yīng)的二抗(Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗大鼠 IgG)室溫下避光孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min；DAPI染色10 min，PBS洗3遍，每遍10 min；甘油封片，熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 八臂迷宮行為學(xué)試驗(yàn) 小鼠BCAS造模30 d后，通過(guò)八臂迷宮評(píng)估小鼠的記憶。采用Shibata M[10]報(bào)道的八臂迷宮實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)前小鼠先適應(yīng)3 d，第4天起開(kāi)始記錄小鼠前8次訪(fǎng)問(wèn)不同臂的個(gè)數(shù)(first eight arm choice)，同時(shí)還要記錄小鼠吃完八臂內(nèi)食物時(shí)所有重復(fù)訪(fǎng)問(wèn)次數(shù)(revisiting errors,RME)一直到第10天，以上記為工作記憶錯(cuò)誤(working memory error,WME)；從第11天起在固定的 2、4、6、8號(hào)臂內(nèi)放置食餌，讓小鼠自由覓食，記錄吃到這幾個(gè)臂內(nèi)食餌前小鼠所犯的錯(cuò)誤，這記為參考記憶錯(cuò)誤(reference memory error,RME)。兩種行為學(xué)檢測(cè)方法都以吃完食餌或15 min結(jié)束作為一次試驗(yàn)。每實(shí)驗(yàn)組小鼠為8只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)不同組的記憶錯(cuò)誤次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)小鼠低灌注損傷后認(rèn)知功能變化的影響 小鼠腦白質(zhì)低灌注損傷模型(BCAS)成功建立后，F(xiàn)TY720對(duì)小鼠造模后認(rèn)知功能的影響通過(guò)8臂迷宮行為學(xué)測(cè)試方法來(lái)檢測(cè)。結(jié)果顯示在小鼠吃完8個(gè)臂內(nèi)食物前重復(fù)訪(fǎng)問(wèn)相同臂次數(shù)(revisiting errors)方面，F(xiàn)TY720治療組明顯低于溶劑組(見(jiàn)圖1A)，而小鼠在完成該任務(wù)時(shí)前8次進(jìn)入不同編號(hào)的臂的個(gè)數(shù)(first eight arm choices)方面，F(xiàn)TY720治療組較空白對(duì)照(Vehicle)組增多(見(jiàn)圖1B)，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明小鼠在低灌注后給予FYY720治療可以減少工作記憶錯(cuò)誤(working memory error,WME)，也就說(shuō)明FTY720治療可以使小鼠短時(shí)記憶受損傷程度降低。在完成吃完4個(gè)固定臂內(nèi)食餌任務(wù)中，3組小鼠重復(fù)進(jìn)入4個(gè)固定臂時(shí)所犯錯(cuò)誤沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明小鼠在BCAS術(shù)后對(duì)參考記憶錯(cuò)誤(reference memory error,RME)(見(jiàn)圖1C)無(wú)明顯影響，也就是說(shuō)明小鼠長(zhǎng)時(shí)記憶在BCAS術(shù)后未見(jiàn)明顯損傷。

2.2 FTY720對(duì)小鼠低灌注后白質(zhì)區(qū)髓鞘結(jié)構(gòu)改變的影響 對(duì)假手術(shù)組(Sham組)、空白對(duì)照組(Vehicle組)及FTY720干預(yù)組(FTY720組)的BCAS 組一個(gè)月的小鼠腦片進(jìn)行LFB 髓鞘染色，對(duì)其損傷程度進(jìn)行評(píng)分。不同白質(zhì)區(qū)域LFB髓鞘染色結(jié)果顯示：FTY720組小鼠可以減輕BCAS后小鼠在胼胝體中央?yún)^(qū)(CCm)、前聯(lián)合(AC)、新紋狀體(CPu)和內(nèi)囊(IC)等區(qū)域中白質(zhì)纖維束中的髓鞘脫失、白質(zhì)纖維排列紊亂、空泡形成等白質(zhì)損傷，與Vehicle組相比FTY720組小鼠的海馬傘端(F)的白質(zhì)損傷也有一定的減輕，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖2)。

2.3 FTY720對(duì)低灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 用Iba1、CD68標(biāo)記的免疫熒光染色的方法檢測(cè)FTY720對(duì)低灌注一個(gè)月后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及吞噬的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vehicle組小鼠在低灌注后，白質(zhì)區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，吞噬增多，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Vehicle組相比，給予FTY720干預(yù)后損傷的白質(zhì)區(qū)域中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，吞噬指標(biāo)CD68表達(dá)明顯降低，提示FTY720干預(yù)可抑制低灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、吞噬(見(jiàn)圖3)。

圖1 八臂迷宮方法檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能：假手術(shù)組(Sham組)、空白對(duì)照組(Vehicle組)及FTY720干預(yù)組(FTY720組)，n=8；A.小鼠在吃完8個(gè)臂食物前重復(fù)訪(fǎng)問(wèn)相同臂次數(shù)，F(xiàn)TY720干預(yù)組與空白對(duì)照組(Vehicle組)相比P<0.001；B.小鼠前8次訪(fǎng)問(wèn)不同臂的個(gè)數(shù)，組間差異P>0.05；C.小鼠完成固定臂內(nèi)食物時(shí)所犯的錯(cuò)誤，即參考記憶錯(cuò)誤，組間差異P>0.05

圖2 給予FTY720對(duì)BCAS術(shù)后不同白質(zhì)區(qū)域 LFB 髓鞘染色結(jié)果的影響：胼胝體中央?yún)^(qū)(CCm)、新紋狀體(CPu)、前聯(lián)合(AC)、內(nèi)囊(IC)、海馬傘端(F)等位置在Sham組、Vehicle組、FTY720組LFB染色結(jié)果， Vehicle組與Sham組相比*P<0.05,**P<0.01;FTY720干預(yù)組與Vehicle組相比#P<0.05，##P<0.01，n=6

圖3 給予FTY720對(duì)BCAS術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響：Iba1，CD68，DAPI共染示意圖，Scale bar,50 μm；Vehicle組與Sham組相比**P<0.01;FTY720干預(yù)組與Vehicle組相比#P<0.05，##P<0.01，n=6

3 討 論

隨著當(dāng)今社會(huì)老齡化的不斷加劇，與年齡相關(guān)的缺血性腦白質(zhì)損傷疾病的發(fā)病率不斷增高。人腦白質(zhì)約占全腦體積的50%，腦白質(zhì)損傷是多種疾病的重要病理過(guò)程，如卒中、血管性癡呆、多發(fā)性硬化等，而慢性低灌注引起的腦白質(zhì)損傷尤為常見(jiàn)[8,9]。因此，要研究缺血性腦白質(zhì)損傷需要建立一個(gè)可靠的慢性低灌注模型。本研究采用低灌注導(dǎo)致的白質(zhì)損傷模型-小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄(BCAS)模型，主要在于這種造模模型更加溫和持久的降低腦血流，更好的模擬低灌注白質(zhì)損傷。

芬戈莫德(FTY720)是一種S1P受體激動(dòng)劑，是治療多發(fā)性硬化的一線(xiàn)藥物[4]。Kwon KJ等的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥是慢性低灌注白質(zhì)損傷的動(dòng)物模型中的關(guān)鍵病理過(guò)程[10]。在Meray Serdar等的研究表明FTY720通過(guò)減少炎癥和氧化應(yīng)激，以及促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟而改善高氧暴露后新生兒的腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷及認(rèn)知功能重建[11]。由此我們推測(cè)，F(xiàn)TY720可能對(duì)低灌注引起的缺血性腦白質(zhì)損傷有保護(hù)作用，且這種作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)炎性有關(guān)。

Foster CA等的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠EAE模型中注射0.3 mg/kg的FTY720可以在腦脊液中檢測(cè)到高濃度的FTY720P[12]，表明FTY720可以通過(guò)血腦屏障，直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，本研究在BCAS術(shù)后，給予小鼠腹腔注射0.3 mg/kg FTY720，每日一次，連續(xù)注射一個(gè)月來(lái)觀察FTY720對(duì)于低灌注腦白質(zhì)損傷的影響和作用。

大量研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦白質(zhì)損傷以膠質(zhì)細(xì)胞增生及髓鞘不同程度脫失為基本特點(diǎn)[8,13]。前額葉-皮質(zhì)下環(huán)路或與工作記憶相關(guān)，BCAS模型降低腦白質(zhì)區(qū)供血，促使白質(zhì)區(qū)軸突-髓鞘完整性受損害，從而使前額葉-皮質(zhì)下環(huán)路與深部白質(zhì)長(zhǎng)聯(lián)系纖維等環(huán)路受損，信息傳遞發(fā)生障礙，導(dǎo)致工作記憶錯(cuò)誤增多[14]。我們的LFB髓鞘染色結(jié)果顯示FTY720治療組小鼠可以減輕BCAS組小鼠在側(cè)腦室旁的胼胝體中央?yún)^(qū)(CCm)、新紋狀體(CPu)、前聯(lián)合(AC)和內(nèi)囊(IC)等區(qū)域中白質(zhì)纖維束中的髓鞘脫失、白質(zhì)纖維排列紊亂、空泡形成等白質(zhì)損傷，且在胼胝體中央?yún)^(qū)最明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FTY720在小鼠低灌注損傷后可以減輕BCAS造模造成的白質(zhì)區(qū)的髓鞘損傷，保持髓鞘結(jié)構(gòu)的完整性。而八臂迷宮結(jié)果顯示FTY720治療可以顯著減少慢性低灌注造成的工作記憶錯(cuò)誤，減輕小鼠短時(shí)記憶受損。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中定居的巨噬細(xì)胞，是對(duì)抗損傷的第一道防線(xiàn)[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，在病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌各種炎癥因子，釋放毒素，促使腦白質(zhì)損傷[10,15]。我們的研究結(jié)果表明FTY720可以抑制低灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對(duì)腦白質(zhì)損害有保護(hù)作用，具有廣闊的臨床實(shí)用前景。