王苗苗，韓飛，嚴歡，王紅麗，李慕春

（新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆烏魯木齊830011）

5α-還原酶是一種微粒體酶，依賴還原型輔酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）為供氫體，將睪酮不可逆地轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿鼜姷?、男性生長必需的二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）[1-2]。但高水平的二氫睪酮容易引起雄激素依賴型疾病，如雄激素性脫發(fā)、良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌等[3-4]。因此，目前通過抑制5α-還原酶來下調(diào)雄激素水平已成為治療雄性脫發(fā)、前列腺增生等雄激素依賴型疾病的重要方法。相比其他雄激素拮抗劑，5α-還原酶抑制劑在選擇性阻斷二氫睪酮合成的同時，不影響睪酮的正常水平和生理功能。故以抑制5α-還原酶活性為靶點，篩選各種來源的5α-還原酶抑制劑的相關(guān)研究工作亦是目前藥物開發(fā)的熱點之一[5]。

5α-還原酶有3種同工酶，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型5α-還原酶受SRD5A1基因編碼，由259個氨基酸組成，最適 pH6～pH8.5；Ⅱ型 5α-還原酶受 SRD5A2 基因編碼，由24個氨基酸組成，最適pH5～pH5.5[6-7]。Ⅰ型5α-還原酶存在于皮膚皮脂腺、汗腺、毛乳頭細胞、成纖維細胞、表皮角質(zhì)形成細胞、毛囊角質(zhì)形成細胞等皮膚組織中。而Ⅱ型5α-還原酶主要存在于前列腺、生殖皮膚、附睪、精囊等組織中[6-8]。III型5α-還原酶目前研究較少，在良性前列腺組織中呈低表達，在難治愈的前列腺癌中過度表達，可將睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮，最適pH6.9[9]。目前已有的一些5α-還原酶抑制劑，如非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺，已廣泛用于臨床上。非那雄胺是美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的第一個 5α-還原酶抑制劑藥物，主要選擇性地抑制Ⅱ型5α-還原酶，用于治療前列腺癌、良性前列腺增生和雄激素性脫發(fā)。度他雄胺對Ⅰ型和Ⅱ型5α-還原酶無選擇性。依立雄胺選擇性和非競爭性地抑制Ⅱ型5α-還原酶。但這3種藥物都有較強的不良反應，如易致勃起功能障礙、性功能異常、性欲降低、男性乳房女性化等[10-11]。因此，從天然植物中尋找高效、低毒的新型5α-還原酶抑制劑十分必要。

5α-還原酶抑制劑按來源一般分為3類：中草藥來源的成分、微生物來源成分及化學合成的化合物[12]。其中，中草藥5α-還原酶抑制劑作為天然植物來源，無明顯不良反應，且來源廣泛，因此，在治療和預防良性前列腺增生（BPH）和前列腺癌等疾病方面具有良好的應用前景[13]。對5α-還原酶有抑制作用的天然成分主要為黃酮類、丙素類、酮類、萜類、甾體類和鞣質(zhì)類化合物[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)薰衣草正丁醇組分生物活性較其他組分高，故本研究以薰衣草正丁醇組分提取物為研究對象，采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）建立了 5α-還原酶抑制劑體外篩選模型，來考察其對5α-還原酶的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

薰衣草：由伊犁紫蘇麗人有限責任公司提供，經(jīng)新疆分析測試研究院阿依古麗副研究員鑒定確認；Lowry法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒、睪酮（分析純）、非那雄胺（分析純）：南京森貝伽生物科技有限公司；還原性輔酶Ⅱ（NADPH）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷[（1，1，1-tris（hydroxymethyl）-methanamin，Tris]：天津市福晨化學試劑廠；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：Fisher公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為去離子水。實驗動物：雄性SD大鼠40只，SPF級，體重180 g～220 g，新疆大學動物實驗中心提供（合格證號SCXK（新）2016-0020）。

1.1.2 儀器設(shè)備

紫外分光光度計（UV-2700）、制備液相色譜儀（LC-20AP）：日本島津公司；碎樣機（RT-02A）：北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；電子天平（TE612-L）：賽多利斯科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS）：上海博迅實業(yè)有限公司；冷卻水循環(huán)機（H50）：萊博科泰公司；超高效液相色譜儀（ACQUITYUPLC）：美國Waters公司；實驗室冷凍干燥機（ALPHA2-4/Ldplus）：德國CHRIST 公司；分析天平（ME204）：梅特勒-托利多；聯(lián)用型平行蒸發(fā)儀（Multivapor P12）：瑞士步琦公司；超純水系統(tǒng)（MINI-QACHANLAGE A10）：美國密理特公司；石英比色皿：大連市日普利科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薰衣草提取物制備

取薰衣草干花適量，用碎樣機粉碎，過篩，保存?zhèn)溆?。稱取粉碎后的樣品于錐形瓶，加入70%的乙醇（料液比 1 ∶10，g/mL），80 ℃回流提取 1 h，過濾，重復提取2次，合并2次濾液，減壓濃縮至無醇味，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得5個組分，減壓濃縮后凍干，稱重，保存；將這5個組分分別進行總黃酮含量的測定，選出最優(yōu)組分為薰衣草正丁醇組分，以正丁醇組分進行試驗，其余組分保存以備后用；取適量薰衣草正丁醇組分提取物加甲醇超聲溶解，定容，進制備液相（YMC C18柱，流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，50 min）按時間收集，得50個組分，濃縮，凍干稱重；取適量甲醇溶解，定容，放于4℃冰箱保存，作為進行5α-還原酶抑制活性測定的樣品溶液。

1.2.2 Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的制備及定量

1.2.2.1 制備

制備方法參考文獻[15]，取雄性SD大鼠40只，禁食不禁水過夜后處死，迅速取肝臟及附睪（剝離脂肪組織），稱重，生理鹽水漂洗，剪碎，加入5倍量預冷的勻漿液[1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris－HCl緩沖液，pH 值分別為 7.5，5.5[肝臟中富含Ⅰ型酶，三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=7.5；附睪中富含Ⅱ型酶液，三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=5.5]在玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4℃及3 000 g離心10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g離心60 min，取上清液即為粗酶，分裝，保存于－80℃超低溫冰箱中，臨用前取出。

1.2.2.2 定量

采用Lowry法蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白含量，以粗酶中的總蛋白含量表示5α-還原酶的濃度，操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 薰衣草提取物對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究

方法參考文獻，反應體系含有50μL提取液、300μL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液[Ⅰ型酶液用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=7.5，Ⅱ型酶液用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液 pH=5.5]、50 μL 1 mmol/L的睪酮、50 μL 2.5 g/L 的非那雄胺、500 μL 酶溶液，加入1 mmol/L NADPH 100 μL后反應開始[15-16]?；旌先芤?7℃溫育60 min，加入1 mL預冷甲醇終止反應，混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液并用0.22 μm濾膜過濾，供檢測睪酮剩余濃度，反應體系見表1。

表1 5α-還原酶的抑制活性研究反應體系Table 1 Reaction system for inhibition activity of 5α-reductase μL

續(xù)表1 5α-還原酶的抑制活性研究反應體系Continue table 1 Reaction system for inhibition activity of 5αreductase μL

用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系統(tǒng)分析檢測睪酮的含量，儀器條件如下：YMC-Triart C18（100 mm×2.0 mm，1.9 μm）；柱溫為 30℃；流動相：乙腈-水（70/30，體積比）；流速0.2 mL/min；檢測器為紫外檢測器，242 nm。配制不同濃度的的睪酮溶液進行液相色譜分析，作標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶粗酶濃度結(jié)果

以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標得出BSA標準曲線見圖1。

圖1 BSA標準曲線Fig.1 The standard curve of the BSA

由圖1可知，BSA標準曲線為Y=0.7875X+0.0657，R2=0.999。經(jīng)計算肝臟中粗酶濃度為22.42 g/L（Ⅰ型酶），附睪中粗酶濃度為1.78 g/L（Ⅱ型酶）。

2.2 薰衣草提取物對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制結(jié)果

配制 0.29、0.58、1.44、2.88、5.77、14.42、28.84 mg/L的睪酮溶液進行液相色譜分析，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，制作睪酮標準曲線。睪酮的標準曲線為 Y=9 175 441.97X+4 165.42，R2=0.999，表明睪酮在0.29 mg/L～28.84 mg/L與峰面積具有良好的線性關(guān)系，可以用于含量測定。睪酮標準溶液的液相色譜圖見圖2。

通過色譜測定反應液中睪酮的含量，抑制活性的強弱用抑制率表征，如下式所示：

圖2 睪酮標準圖譜Fig.2 UPLC chromatogram of testosterone standard

抑制率/%=（空白管睪酮濃度的變化值－樣品管睪酮濃度的變化值）/空白管睪酮濃度的變化值×100

樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性見表2、圖 3、圖 4。

表2 樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性數(shù)據(jù)表Table 2 The inhibitory activities towards the two 5α-reductase isozymes

續(xù)表2 樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性數(shù)據(jù)表Continue table 2 The inhibitory activities towards the two 5αreductase isozymes

圖3 提取物對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅠ

圖4 提取物對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅡ

由圖3、圖4及表2可知，大部分薰衣草正丁醇提取物對Ⅰ型5α-還原酶（肝臟）表現(xiàn)出了抑制作用，其中20、43、44、50號提物作用較為顯著；除薰衣草正丁醇提取物21、35、44號樣品外，其余樣品均對Ⅱ型5α-還原酶（附睪）表現(xiàn)出了抑制作用，其中43號提取物作用較為顯著；同時也可看出薰衣草正丁醇提取物對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用明顯高于對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用。

綜上所述，薰衣草正丁醇提取物有39個樣品對Ⅰ型5α-還原酶有抑制作用，有48個樣品對Ⅱ型5α-還原酶有抑制作用，雖然對Ⅱ型5α-還原酶抑制作用較廣泛，但對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用強（抑制率>50%）的樣品個數(shù)更多。

3 結(jié)論與討論

目前報道的5α-還原酶抑制劑體外篩選方法有放射性同位素法、紫外分光光度計法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相法等，各方法中酶的制備方法、檢測原理和數(shù)據(jù)分析手段相似。各篩選方法的具體特點表現(xiàn)為：放射性同位素法靈敏度高，效率高，但因涉及放射性危險，需要檢測同位素的專有儀器，方法開展場地受限；紫外分光光度計法利用分光光度計來檢測結(jié)果，儀器易獲取、操作簡單快捷、經(jīng)濟實用，避免了放射性危險因素，缺點是由于NADPH是許多酶的輔酶，所以在5α-還原酶純度不高的情況下，實驗結(jié)果易受到其他酶影響導致準確度下降；氣相色譜-質(zhì)譜法檢測準確度較好，干擾較少，但需要大型的專有儀器，方法開展也受限；高效液相法5α-還原酶抑制劑體外篩選模型在借鑒分光光度計法和同位素法的基礎(chǔ)上，通過液相色譜儀進樣，使5α-還原酶抑制劑體外篩選過程程序化，準確度高，重復性好，干擾少，同時，克服了同位素法存在放射性危險這一弊端，縮短了藥物篩選周期，提高工作效率。

在本研究中，采用（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法建立了穩(wěn)定的5α-還原酶抑制劑的體外篩選模型，研究發(fā)現(xiàn)，薰衣草正丁醇部分20、43、44、50號樣品均為潛在5α-還原酶抑制劑（對Ⅰ型5α-還原酶的抑制率分別為54.02%、58.79%、57.74%、53.73%，對Ⅱ型5α-還原酶的抑制率分別為30.88%、59.94%、-0.06%、26.12%），這可能導致發(fā)展新的天然藥物治療雄激素相關(guān)疾病，但提取物中的物質(zhì)尚未完全清楚，有必要進行進一步的標準化植物成分的識別，此外，其可能的作用機制尚未明朗，還需要通過進一步的研究探索。