羅文濤 何啟蓋 陳芳洲 李 靜 周杰瓏

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

豬腹瀉病對(duì)我國(guó)乃至全球生豬產(chǎn)業(yè)危害巨大[1]，造成豬群腹瀉的病原主要是病毒，其次是細(xì)菌和寄生蟲等[2]。豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)、豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬A群輪狀病毒 (PoARV)、豬C群輪狀病毒 (PoCRV)、豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2) 是常見(jiàn)的病毒性腹瀉病原[3-4]。針對(duì)病毒性病原的常規(guī)檢測(cè)方法包括：病毒分離鑒定、常規(guī)PCR、熒光定量PCR、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光 (IFA)、ELISA等方法，但是以上方法都建立在已獲得病毒基因序列和相應(yīng)抗體的基礎(chǔ)上，無(wú)法檢測(cè)未知的病毒。

下一代測(cè)序技術(shù) (NGS) 又稱第2代測(cè)序或高通量測(cè)序，是新世紀(jì)開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的新測(cè)序技術(shù)，在2007年NGS被 《Nature Methods》 評(píng)選為生物領(lǐng)域影響力最大的突破性技術(shù)[5]。NGS的發(fā)展為生物學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的思路，在微生物、植物、人類疾病方面都得到了廣泛應(yīng)用，近幾年在獸醫(yī)領(lǐng)域也愈發(fā)受到重視，開(kāi)始在與動(dòng)物疾病相關(guān)的病原學(xué)、基因組學(xué)、流行病學(xué)等領(lǐng)域得到應(yīng)用。基于NGS發(fā)展起來(lái)的病毒宏基因組學(xué)實(shí)現(xiàn)了對(duì)海洋、污水、淡水湖[6-7]及蝙蝠、火雞、豬等動(dòng)物的組織、糞便、血液[8-10]中病毒群落的宏基因組學(xué)分析。該技術(shù)具有高通量、高精度、高效率等1代測(cè)序不可比擬的優(yōu)勢(shì)，可以一次性檢測(cè)出環(huán)境(有機(jī)環(huán)境和無(wú)機(jī)環(huán)境)中的所有病毒核酸，有助于同時(shí)檢測(cè)多種豬群疾病和發(fā)現(xiàn)新的病原。本研究通過(guò)采集四川省某反復(fù)暴發(fā)腹瀉豬場(chǎng)的仔豬腸道樣品，進(jìn)行NGS測(cè)序分析，再利用常規(guī)PCR方法對(duì)NGS結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，找到引發(fā)該豬場(chǎng)腹瀉問(wèn)題的病毒，為相關(guān)豬場(chǎng)后期免疫方式及程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年10月于四川省某反復(fù)出現(xiàn)2～4日齡仔豬腹瀉的豬場(chǎng)采集了9份發(fā)病仔豬全部腸道組織，所有腸道組織混合勻漿，反復(fù)凍融3次，進(jìn)行NGS樣品處理。

1.2 主要試劑

DNase I、RNase A、DNTPs、Recombinant RNase Inhibitor、M-MLV RTase、Klenow fragment購(gòu)自大連寶生物公司 (TaKaRa)。Phi29DNA polymeras購(gòu)自北京NEB公司。DNAeasy Blood & Tissue Kit、RNeasy Mini Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。AxyPrep Plasmind Minirep Kit、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自Axygen (杭州) 公司。2 × Master Mix購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

隨機(jī)引物及特異性引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，PEDV檢測(cè)引物根據(jù)其M基因[11]設(shè)計(jì)，F(xiàn): TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG, R: CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC，產(chǎn)物668 bp；PEDV測(cè)序引物根據(jù)其S基因設(shè)計(jì)，F(xiàn): TTGAAGAATGGTAAGTTGC, R: GCACTAGTAACATTAAG，產(chǎn)物708 bp；PCV3的檢測(cè)引物為：F: ATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTG, R: TAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTC，產(chǎn)物374 bp。

1.4 儀器設(shè)備

PCR儀由美國(guó)Bio-Rad公司制造；恒溫水浴鍋由富華儀器有限公司制造；超凈工作臺(tái)由北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司制造；常溫或冷凍離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司制造；-80 ℃超低溫冰箱由Thermo公司制造；Nanodrop 2000分光光度計(jì)由Thermo公司制造；瓊脂糖凝膠電泳儀由北京六一儀器廠制造。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1NGS測(cè)序樣品制備

將組織勻漿液12 000 r/min離心5 min后，上清液經(jīng)0.45 μm、0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌，備用；取濾液130 μL加入15 μL 10 × DNase I buffer、4 μL DNase I、1 μL RNase A，共計(jì)150 μL體系，37 ℃持續(xù)1 h進(jìn)行外源核酸消化；消化完畢，應(yīng)用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit病毒基因組提取試劑盒提取豬糞便中病毒群落的DNA；應(yīng)用 QIAGEN RNeasy Mini Kit病毒基因組提取試劑盒提取豬糞便中病毒群落的RNA，取13 μL RNA，加入1 μL隨機(jī)引物、0.5 μL M-MLV RTase、1 μL dNTPs，42 ℃金屬浴1 h；75 ℃滅活M-MLV RTase活性10 min，反轉(zhuǎn)錄成sscDNA；sscDNA使用Klenow fragment在37 ℃反應(yīng)1 h，合成dscDNA；將提取的DNA及dscDNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增 (SISPA)，產(chǎn)物經(jīng)純化、濃縮后送至南京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行宏基因組建庫(kù)測(cè)序。

1.5.2常規(guī)PCR檢測(cè)

針對(duì)NGS分析得到的病毒信息，使用常規(guī)引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，引物序列見(jiàn)1.3。PEDV-M反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min →(94 ℃, 50 s → 55 ℃, 1 min → 72 ℃, 1 min)35個(gè)循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PEDV-S反應(yīng)條件為：94 ℃, 4 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 45 s) 35個(gè)循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PCV3反應(yīng)條件為：94 ℃, 5 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 40 s) 35個(gè)循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 NGS檢測(cè)結(jié)果

樣品中共獲得1 388 488條reads，其中997 082條注釋到細(xì)菌 (Bacteria)，占比72%；53 805條注釋到古細(xì)菌 (Archaea)，占比4%； 334 584條注釋到病毒，占比24%。在病毒reads中Caudovirales占比達(dá)94%，主要是為噬箘體目的一些序列，見(jiàn)圖1a；豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) reads為2 352條，占病毒reads的0.7%，占整個(gè)樣品的0.2%，見(jiàn)圖1b。

在樣品中還存在1%的reads屬于Circoviridae SFBeef，其占到了病毒reads的5%，通過(guò)查看該reads的解釋可知這是屬于環(huán)病毒科 (Circoviridae) 的一種新型病毒，其reads經(jīng)拼接后可知該新型環(huán)狀病毒即為豬圓環(huán)病毒3型 (PCV3) (圖1c)。

2.2 病毒PCR特異性檢測(cè)與分析

2.2.1PEDV驗(yàn)證與分析

根據(jù)NGS分析得到的結(jié)果，合成常規(guī)引物對(duì)PEDV進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，得到的結(jié)果如圖2a所示，可以看到出現(xiàn)約668 bp的目的條帶，常規(guī)檢測(cè)與NGS檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)該P(yáng)EDV陽(yáng)性病料擴(kuò)增PEDV S1基因，得到結(jié)果如圖2b，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序，依據(jù)S1基因測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看到該樣品中的PEDV與該豬場(chǎng)此前送檢的PEDV為相同毒株，且該場(chǎng)PEDV毒株為獨(dú)立的1個(gè)分支，可能為一新型變異毒株，這也揭示了為什么疫苗無(wú)法完全控制該場(chǎng)腹瀉反復(fù)暴發(fā)的原因。

圖2 樣品S中PEDV M基因與S基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The detection result of PEDV M gene and S gene

●：該樣品來(lái)源豬場(chǎng)此前所測(cè)得的序列；▲：本樣品中測(cè)得的序列。

2.2.2PCV3驗(yàn)證與分析

根據(jù)PCV3 ORF2基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果如圖4。

由圖4可知，NGS檢測(cè)結(jié)果與特異性PCR檢測(cè)結(jié)果一致，且擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果說(shuō)明樣品中確定存在PCV3。本研究利用PCV3的reads成果拼接出該病毒的一條全基因組，據(jù)該全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5。在親緣關(guān)系上與韓國(guó)KU-1506 (NCBI登錄號(hào)：KY996345.1) 最為接近。

圖4 PCV3擴(kuò)增后電泳圖Fig.4 Electrophoresis analysis of PCV3

▲為本研究獲得的毒株。

3 結(jié)論與討論

在臨床樣品的病毒reads中噬菌體 (Phage) 占比94%，噬箘體在1915年在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)[12]，1917年被命名為噬箘體，即為吞噬細(xì)菌之意[13]，噬箘體是一種細(xì)菌病毒，具有殺死細(xì)菌的功能[14]，在調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著巨大作用[15]。樣品中的噬菌體占比較大，這是因?yàn)楦篂a樣品主要為仔豬腸道，腸道中存在大量細(xì)菌，相應(yīng)的也存在大量噬菌體，噬菌體與宿主之間并不是完全的捕食性關(guān)系，大多維持平衡的共生狀態(tài)，根據(jù)環(huán)境決定是否發(fā)生裂解-溶原經(jīng)過(guò)[16]。

PEDV屬于尼多病毒目 (Nidovirales)，冠狀病毒科 (Coronaviridae)，冠狀病毒屬 (Alphacoronavirus) 的一種單鏈RNA病毒[17]。PEDV可引起豬流行性腹瀉 (PED)，PED主要導(dǎo)致一周齡內(nèi)的仔豬腹瀉，同時(shí)伴隨嘔吐、厭食、脫水和體重減輕。PEDV的 病理變化主要是導(dǎo)致豬空腸和回腸的腸絨毛萎縮和脫落[18]。PEDV自2010年來(lái)先后在廣東、河南、武漢、四川等地被檢測(cè)到[19]。成為近十年我國(guó)仔豬腹瀉的主要病原。本研究中發(fā)現(xiàn)豬群感染PEDV導(dǎo)致的腹瀉，并且進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)PEDV屬于獨(dú)立的一個(gè)分支，所以該場(chǎng)注射的疫苗后防控效果不佳。

PCV3是一種單鏈環(huán)狀DNA，全基因組具有2000個(gè)核苷酸，在復(fù)制期間單鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，并具有3個(gè)開(kāi)放閱讀框 (ORF)。ORF1是最大的開(kāi)放性閱讀框，并且編碼與圓環(huán)病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白，ORF3編碼的蛋白還不清楚[20-21]。Phan等于2016年通過(guò)NGS技術(shù)首先在患有心肌炎的豬群樣品中檢測(cè)到該病毒[20]，同年P(guān)alinski等也在豬皮炎與腎臟綜合征 (PDNS) 樣品豬檢測(cè)到PCV3[21]。于2016年報(bào)道了國(guó)內(nèi)首例PCV3[22]，隨即韓國(guó)及波蘭均有在豬群中檢測(cè)出PCV3的報(bào)道[23-25]。研究顯示在肺臟、腦、淋巴結(jié)、扁桃體、血清等樣品中均可檢出PCV3，陽(yáng)性豬群臨床癥狀包括腹瀉、繁殖障礙、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PMWS) 等[23]。目前PCV3的致病性還不明確，其和豬群腹瀉之間是否有直接聯(lián)系還不清楚。但是豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2) 臨床上可以引起豬群腹瀉[26]，并且具有免疫抑制的作用[27]，使得感染其他疾病的可能性增加，PCV3可能存在與其相似的致病機(jī)制。PCV3可以在腸道組織中檢出，提示其腸道致病性的可能。

通過(guò)本研究證實(shí)了NGS技術(shù)在豬群疾病檢測(cè)中應(yīng)用前景巨大，同時(shí)證明臨床腹瀉仔豬腸道中存在PEDV與PCV3混合感染的情況，豐富了對(duì)于豬群腹瀉疾病病毒感染情況的認(rèn)知。但是目前NGS技術(shù)用于疾病檢測(cè)價(jià)格相對(duì)較高，且周期較長(zhǎng)，在后期實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室建庫(kù)自主化之后，可以大大降低時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，可在豬群復(fù)雜臨床癥狀的診斷中推廣使用。