文鳳娟 龔廷鋒 賴清玉 李云濤 趙明富 徐紹忠 文國松

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201)

云南丹參 (Salviayunnanensis) 為唇形科 (Labiatae) 鼠尾草屬 (Salvia) 植物，在 《中國植物志》 上名為云南鼠尾草，又名滇丹參、紫丹參、紫參、小紅黨參、奔馬草、小丹參、小紅草烏、山檳榔和朱砂理肺散[1-3]，產(chǎn)于云南東部至西部、貴州西部、四川西南部的山坡草地、疏林干燥地上或林邊路旁，海拔1 800～2 900 m。該植物首載于 《滇南本草》，在云南地區(qū)作為藥用植物歷史悠久，在 《中國植物志》 記載療效同丹參[2-4]，在 《中國藥典》 2015版中只有丹參 (Salviamiltiorrhiza) 作為正品藥用丹參收載和使用[5]。錢子剛等[4]研究發(fā)現(xiàn)與正品藥用丹參相比，云南丹參的總丹參酮、總酚酸、丹參酮IIA都較高，本品在 《云南省藥品標準》 1974 年版中收載。前人對云南丹參的鑒定是基于生物學性狀、顯微結構、理化鑒別以及化學成分的分析等[6-11]，ITS條形碼分析法與上述分析方法相比，DNA反映的是物種的遺傳本質(zhì),它受環(huán)境的影響比較小，能夠較好地解析種內(nèi)種間的差異[12-13]，相對于其他分子標記技術較準確和方便[14]。本研究采用ITS技術對不同原產(chǎn)地云南丹參及其近緣種 (丹參、椴葉鼠尾草S.tiliifolia) 進行分析，初步了解云南地區(qū)云南丹參的種類和分布，分析ITS技術是否能夠快速準確地鑒別出云南丹參和正品藥用丹參，為后續(xù)研究鑒別云南丹參提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

分別從8個地區(qū)采集的8份實驗樣品，經(jīng)專家鑒定，樣品信息見表1。

表1 試驗樣品信息Table 1 Information of all samples

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取

采用劉靈娣等[15]、葉磊等[16]的CTAB法改良后，分別提取各樣品的基因組DNA。取新鮮幼嫩的葉片1 g，研缽用流水洗凈之后干燥，再用液氮預冷處理，樣品放入研缽中，用液氮研磨成極細的粉末，傾倒入2 mL的離心管中，加入1 mL CTAB緩沖液 (65 ℃預熱)，65 ℃水浴45 min，期間不斷顛倒混勻；10 000 r/min，室溫離心15 min，取上清到新的2 mL的離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇 (體積比24∶1) 輕輕混勻5～10 min；輕輕吸取上層液體，重復上一步操作，直到中間層無白色沉淀；取上層液體，加入1/10體積的3 mol/L NaAc，加入2倍體積的無水乙醇 (-20 ℃預冷)，輕輕混勻，-20 ℃放置20 min；10 000 r/min室溫離心15 min,棄上清；沉淀用75%的乙醇洗滌2次，棄上清，室溫干燥后，加80 μL TE緩沖液溶解沉淀。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量；用紫外分光光度計在260 nm和280 nm處，測出其吸光度A，計算DNA純度和濃度。

1.2.2PCR擴增與測序

通過NCBI下載已報道的云南丹參和藥用丹參的序列 (表2) 進行BLAST比對后，用Primer5.0進行引物設計 (表3)。4個來自NCBI的模板序列都包括部分18S核糖體RNA基因，ITS1序列，5.8S核糖體RNA基因，ITS2序列，部分28S核糖體RNA序列。

表2 ITS序列信息Table 2 Information of ITS sequences

表3 ITS引物序列Table 3 Primer sequence of ITS

PCR的擴增體系及程序參考鐘志敏等[17]，李沛清等[18]的操作，并通過優(yōu)化后，分別對8個樣品的ITS序列進行擴增，選取引物(A/B)擴增各樣品ITS序列。擴增體系為50 μL：上下游引物各2 μL，模板1 μL，2 × PowerTaqPCR MasterMix 25 μL，ddH2O 20 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。檢測后，將條帶明亮且單一的PCR產(chǎn)物送去雙向測序。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析

將上述雙向測序的結果進行校準拼接，與來自GenBank的模板序列做比對后，進行序列剪輯，去除引物區(qū)和低質(zhì)量片斷區(qū)，用軟件MEGA 6.0把樣品序列和GenBank的4條模板序列剪輯成只含有ITS完整序列的片斷。采用DNAMAN 8.0進行堿基統(tǒng)計和序列比對；應用軟件MEGA 6.0構建NJ系統(tǒng)進化樹；并應用軟件RNAstruct 6.0對各樣品序列的ITS1和ITS2進行二級結構預測。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果分析

PCR擴增結果顯示：擴增效率為100%，引物 (C/D、E/F、G/H) 擴增的大小都在750 bp左右，引物 (A/B) 擴增大小在700 bp左右 (圖1)，最接近ITS的長度，所以選擇該產(chǎn)物進行測序。

M為DNA marker；1～8為樣品編號。

2.2 序列比對

Blast比對結果顯示，樣品DS1與模板KJ397256.1的ITS序列完全一致，序列相似性100%；樣品YN4與模板KJ397258.1的ITS序列完全一致，序列相似性100%。表明測序結果質(zhì)量較好，真實可信。

樣品YN1、 YN2、 YN3、 YN4、 DS1、 DS2、 DS3的ITS序列的全長為621 bp，包括ITS1、ITS2、5.8S的序列，其中ITS1序列長度為229 bp，5.8S序列長度為164 bp，ITS2序列長度為228 bp；樣品ST的ITS序列的全長為626 bp，也包括ITS1、ITS2、5.8S的序列，其中ITS1序列長度為229 bp，ITS2序列長度為233 bp，5.8S序列的長度為164 bp。各樣品的的ITS長度及GC含量見表4，當空位 (Gap) 作缺失處理時，ITS區(qū)全序列排序后長度為629 bp，即ITS的比對長度是629 bp。

表4 ITS序列長度和 (G + C) 含量Table 4 Length and (G + C) content of ITS sequence

ITS1比對長度為232 bp，變異位點為54個，占該區(qū)位點的23.28%，簡約信息位點8個，如表5，簡約信息位點是變異較大的位點。對于其他變異較小的位點只存在個別種，如樣品ST，可作為外來種，或個別種來看待。上述8種樣品的ITS1序列的差異百分率是0%～23.28%，不同產(chǎn)地的云南丹參的ITS1差異百分率序列差異百分率為0=～2.18%。

表5 ITS1簡約信息位點Table 5 Parsimony informative site of ITS1

ITS2比對長度為233 bp，變異位點52個，占該區(qū)位點的22.32%，簡約信息位點10個，如表6，較小的變異位點大多出現(xiàn)在樣品ST中，以上8種樣品的ITS2序列的差異百分率是0～21.89%，不同產(chǎn)地的云南丹參的ITS2差異百分率為0～1.75%。

表6 ITS2簡約信息位點Table 6 Parsimony informative site of ITS2

5.8S比對長度為164 bp，變異位點3個，占5.8區(qū)位點的1.8%，無簡約信息位點，這3個變異位點只出現(xiàn)在樣品ST序列中，其他樣品的5.8S序列完全一致，相似性100%。

序列變異的分析結果表明，兩側的ITS1、ITS2區(qū)的變異位點較多；5.8S區(qū)變異位點少，具有較高的保守性；云南丹參與藥用丹參的ITS1、ITS2的序列差異較大，差異的堿基及位點的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，即在特定的位點變異，且變異的堿基大多相同；不同產(chǎn)地的云南丹參之間變異較小。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

以ITS序列為數(shù)據(jù)，用鄰位相接法 (NJ) 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹 (圖2)。分析結果顯示，所有樣品可以分為3個大類。樣品ST單獨為第1類群；YN1、YN2、YN3、YN4、EF373615.1、KJ397258.1聚為第2類群，節(jié)點支持率為95%；DS1、DS2、DS3、KR082761.1、KJ397256.1聚為第3類，節(jié)點支持率為97%。在第2類群中，YN2與YN4聚為一小類，節(jié)點支持率為95%這兩個樣品的來源地理位置比較靠近。表明ITS序列可以準確地鑒別出云南丹參與正品藥用丹參；在不同產(chǎn)地的云南丹參中，地理來源靠近的云南丹參聚為一小類，這一小類的節(jié)點支持率為95%，其他產(chǎn)地的云南丹參，通過ITS序列聚類，沒有較高的可信度，還不能完全區(qū)分出，還需要其他條形碼的輔助。

2.4 2級結構預測

為了進一步了解云南丹參及近緣種ITS區(qū)序列的差異，本文分別對8個樣品的ITS1、ITS2序列進行2級結構預測。各樣品序列結構預測結果見圖3～4。

圖2 基于ITS序列構建的鄰接 (NJ) 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on ITS sequence

圖3 ITS1序列的2級結構Fig.3 Secondary structure of ITS1 sequence

樣品YN1、YN3、DS1、DS2的ITS1的2級結構預測見圖3a，樣品YN2的ITS1 2級結構預測見圖3b，樣品YN4的ITS1 2級結構預測見圖3c，樣品DS3的ITS1 2級結構預測見圖3d。樣品ST的ITS1的2級結構預測見圖3e。在ITS1序列中，由于各樣品堿基組成的少量差異，導致其2級結構預測圖的差異。a有12個莖環(huán)，b有18個莖環(huán)，c有13個莖環(huán)，d有13個莖環(huán)，e有16個莖環(huán)，但c中有1個莖環(huán)與d中1個莖環(huán)形成的位置不一樣，c中從47～81 bp之間形成3個莖環(huán)，而d在47～81 bp之間形成2個莖環(huán)。雖然a、b、c、d、e之間有差異，但也有相同的結構區(qū)。a、b、c、d在50～78 bp、90～120 bp、130～153 bp形成的莖環(huán)數(shù)量和結構一樣，差異較大的e在180～201 bp與a、c、d在179～202 bp形成的莖環(huán)結構相同。表明ITS1的2級結構的預測結果能在一定程度上鑒別云南丹參與正品藥用丹參，并且能鑒別出部分不同產(chǎn)地的云南丹參。

圖4 ITS2序列的2級結構Fig.4 Secondary structure of ITS2 sequence

由圖4可知，樣品YN1、YN2、YN3、YN4的ITS2的2級結構預測圖為f，樣品DS1、DS2、DS3的ITS2的2級結構預測圖為h，樣品ST的ITS2的2級結構預測圖為m。圖m、f中有部分莖環(huán)結構相同，如m、f在10～40 bp、50～80 bp、90～170 bp、210～220 bp形成的結構相同。由于樣品ST的ITS2序列的堿基數(shù)量與其他樣品不同，導致其ITS2序列的2級結構預測圖與其他樣品ITS2序列2級結構預測圖差異很大。f有14個莖環(huán)結構，h有15個莖環(huán)結構、m有19個莖環(huán)結構。f、h主要的差異在180～228 bp形成的莖環(huán)結構和折角的位置不一樣。由此表明ITS2的2級結構預測結果圖能準確地鑒別云南丹參和正品藥用丹參，并能初步區(qū)分其他鼠尾草屬近緣種，但在不同產(chǎn)地云南丹參之間沒鑒別力。

由上述ITS1、ITS2的2級結構預測結果分析中，ITS1、ITS2的2級結構預測圖應該聯(lián)合應用，單獨使用其中之一其鑒別力不夠。在云南丹參及近緣種的鑒別中，可以先使用ITS2的2級結構預測圖來鑒別出云南丹參，然后再利用ITS1的2級結構預測圖來進行不同產(chǎn)地云南丹參的鑒別。綜合所述，ITS1、ITS2序列的2級結構，無論從莖環(huán)位置還是莖環(huán)數(shù)量，不同種類間都顯現(xiàn)出較大的變化，表現(xiàn)出了一定的種間特異性。

3 結論與討論

云南丹參為云南地方性藥材,首載于 《滇南本草》[7]，是唇形科鼠尾草屬植物。鼠尾草屬是唇形科的一個大屬，全世界約1 000種，我國約有83個種，25個變種，9個變型，該屬藥用植物種類眾多，分布廣，變異大，其系統(tǒng)分類、品種鑒定以及資源利用一直都相當混亂。以根作為丹參用的同屬植物有30多種，各地常作丹參用的有9種[19]。就連在云南大理地區(qū)作為丹參藥材出售入藥的植物有4種，它們是紫丹參 (云南丹參) (S.yunnanensis)、大紫丹參 (褐毛甘西鼠尾草) (S.przewalskiivar.mandarinorum)、丹參 (S.miltio-

rrhiza)、小紅丹參 (三葉鼠尾草) (S.trijuga)[20]。由此可知丹參類生藥來源種類繁多，云南丹參作為丹參類生藥來源的一種，要想與其他近緣種區(qū)分開，需要一種快速有效的方法。研究人員對丹參類藥材的鑒別從生物性狀、顯微結構、理化鑒別、化學成分定性定量分析等方面進行比較分析或通過篩選建立分子標記來鑒別。但上述研究工作過于繁鎖與龐大。本研究采用DNA條形碼技術來鑒別云南丹參及近緣種。中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則已經(jīng)納入2010版 《中華人民共和國藥典》 第3增補本[21]。DNA條形碼依靠DNA片斷承載著物種的遺傳信息，在同種或同一品種的生物體中遺傳信息高度穩(wěn)定，不受生物個體發(fā)育或生長環(huán)境以及藥材生產(chǎn)加工后外觀和性狀改變的影響[22]。

ITS條形碼技術是使用一條較短的DNA片斷作為條形碼來快速準確地鑒別物種的技術[23]。ITS序列位于18S和26S之間。ITS序列被5.8S分隔成ITS1和ITS2。ITS1、ITS2作為非編碼區(qū)，所承受的選擇壓力較小，堿基替換速率較快，可以提供豐富的遺傳信息。ITS條形碼技術還具有樣品用量少，精準快速的優(yōu)點，已廣泛應用于藥用植物資源的鑒定中[24]，如北柴胡 (Bupleurumchinense)、枸杞 (Lyciumchinense)、芍藥 (Paeonialactiflora)、銀蒿 (Artemisiaaustriaca)及其近緣種的鑒定研究中，證明了ITS條形碼的準確性和穩(wěn)定性[25-28]。

通過資料查閱和本課題組的研究發(fā)現(xiàn)云南丹參主要分布于我國西南地區(qū)，目前云南丹參藥材的資源非常少，主要依靠野生資源的采挖，收集難度大。正品藥用丹參的野生資源主要分布于我國的中東部地區(qū)，在全國各地都有栽培。云南丹參近緣種的褐毛甘西鼠尾草、三葉鼠尾草在一些地方作為丹參類藥材使用，也分布在我國的西南地區(qū)[29-31]。正因為丹參類藥材混亂，分布情況復雜，ITS條形碼技術操作簡單，分析方法準確，因此急需要ITS條形碼這種快速準確的方法來鑒別云南丹參的真?zhèn)?。由于本研究中的實驗材料比較少，不能完全確定ITS條形碼是否能夠準確的鑒別云南丹參的真?zhèn)?，后續(xù)還需要更多產(chǎn)地材料的收集。

本研究采用ITS條形碼鑒定云南丹參及近緣種，結果顯示：ITS序列在云南丹參、正品藥用丹參及近緣種椴葉鼠尾草中變異適度、遺傳信息豐富，能夠準確地鑒別云南丹參、藥用丹參、及近緣種椴葉鼠尾草，并在不同產(chǎn)地的云南丹參的鑒別中有一定的區(qū)分度。ITS序列分析在云南丹參的快速鑒別方面有一定的優(yōu)勢，為云南丹參藥材進行源頭把關，為其資源的合理開發(fā)利用提供了重要的參考價值和科學依據(jù)。