王 巖， 張 翔， 安麗君

(旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

表皮毛是植物地上部組織表皮向外突出形成的單細胞或多細胞結(jié)構(gòu)[1-2]。表皮毛作為植物與環(huán)境接觸的最外層屏障，具有多種生理、生態(tài)功能。表皮毛的存在能抵御植食性昆蟲和病原菌對植物體的危害[3]；也可以減少植株熱量的散失，提高植物對冷害的抗性[4-5]；同時也能減少植物對太陽輻射的吸收，保護組織免受紫外線和極端溫度的傷害[6]；增強葉片對空氣中水蒸氣的儲藏能力，提高植物的抗旱性等[7]，以及吸收重金屬元素，提高植物對土壤重金屬污染的防御[8-9]。另外，表皮毛作為一種特化的表皮細胞，也是研究細胞命運決定、細胞周期調(diào)控、細胞極性生長以及細胞成熟的優(yōu)良模式系統(tǒng)[10]。

在模式植物擬南芥中，表皮毛存在于除下胚軸和子葉外的幾乎所有氣生器官上，如蓮座葉、主莖、莖生葉以及花瓣等[11]。擬南芥蓮座葉上的表皮毛為典型的單細胞結(jié)構(gòu)，形態(tài)上通常為3～4個分支，其發(fā)育過程受到多種因子的調(diào)控[12]。其中KAK基因編碼1個HECT泛素蛋白連接酶，抑制表皮毛細胞從有絲分裂向核內(nèi)復(fù)制過程的轉(zhuǎn)變，KAK基因功能缺失導(dǎo)致細胞核DNA含量升高，表皮毛分支數(shù)增加[13]。

本試驗在以擬南芥表皮毛突變體gl2-3為背景的EMS二次誘變庫中，篩選獲得了1個蓮座葉表皮毛分支數(shù)明顯增加的突變體abt2。通過回交并觀察后代的表皮毛表型，發(fā)現(xiàn)abt2是細胞核單基因控制的隱性突變體；圖位克隆以及雜交試驗證實突變基因abt2是KAK基因的一個新等位基因，abt2的突變表型是由于KAK基因第+6 881 bp處核苷酸發(fā)生突變所導(dǎo)致的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Columbia(Col-0)、Landsbergerecta(Ler)、gl2-3(SALK_039825)突變體純合體、KAK基因T-DNA插入功能缺失突變體SALK_037636由筆者所在實驗室保存。gl2-3背景的EMS突變體庫由筆者所在實驗室創(chuàng)制保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物的培養(yǎng)與候選突變體篩選 將gl2-3背景的EMS誘變體庫按庫種植在充分吸水后的進口品氏基質(zhì)泥炭土(pindstrup substrate peat moss)上，4 ℃黑暗處理3 d后移入植物培養(yǎng)間，培養(yǎng)溫度為(22±2)℃，相對濕度為70%，24 h 持續(xù)光照，光照度為100 μmol/(m2·s)。待植株生長2周后觀察蓮座葉葉表皮毛發(fā)育狀況，篩選表皮毛發(fā)育異常的植株作為候選突變體。

1.2.2 突變體遺傳背景純化及遺傳分析 先將候選突變體進行自交并觀察后代表型，選取突變表型明顯且能穩(wěn)定遺傳的候選突變體作為目標(biāo)突變體；再以擬南芥Col-0為母本，目標(biāo)突變體為父本進行回交，觀察F2代群體中出現(xiàn)的表型并統(tǒng)計分離比，判斷突變基因的顯隱性以及控制突變表型的基因數(shù)目；另外，通過正反交試驗判斷突變表型的遺傳方式。

1.2.3 圖位克隆 將確定的目標(biāo)突變體與擬南芥Ler生態(tài)型進行雜交，在F2代植株中挑選具有突變體表型的植株作為圖位克隆群體。首先提取95株作圖群體中植株的基因組DNA，構(gòu)建DNA池(bulk)，利用已經(jīng)公布的均勻覆蓋擬南芥5條染色體的27對分子標(biāo)記為引物進行PCR，通過統(tǒng)計突變位點與分子標(biāo)記的連鎖情況，判斷突變位點所在的染色體區(qū)間；確定突變位點所在區(qū)間及與其連鎖的側(cè)翼分子標(biāo)記后，擴大作圖群體，設(shè)計新分子標(biāo)記進行精細定位。

1.2.4 候選基因的確定 根據(jù)精細定位的區(qū)間，在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(www.arabidopsis.org)中下載該區(qū)間內(nèi)所覆蓋的全部基因，查閱相關(guān)資料，篩選出候選突變基因；然后針對這些候選突變基因設(shè)計引物進行PCR擴增并測序，最終確定出突變基因。

1.2.5abt2與SALK_037636突變體之間的遺傳互作分析 將abt2與SALK_037636雜交，觀察F1代植株的表型，驗證KAK基因與abt2基因之間的等位性。

1.2.6 表皮毛分支表型分析 將Col-0、abt2、SALK_037636及abt2×SALK_037636 F1代植株培養(yǎng)3周后，觀察并統(tǒng)計第3、第4張蓮座葉上具有不同分支數(shù)的表皮毛數(shù)量，并計算各種類型表皮毛所占的比例。每種基因型植株至少統(tǒng)計20株，利用GraphPad Prism 6軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 abt2突變體的獲得和表型分析

為獲得參與調(diào)控擬南芥表皮毛發(fā)育的新基因，構(gòu)建了以植物表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子GL2功能缺失突變體gl2-3為背景的EMS誘變庫，并進行了大規(guī)模的遺傳篩選。在此過程中獲得了1個蓮座葉表皮毛分支數(shù)明顯增加的突變體，將其命名為abt2(aberrant trichome 2)。通過統(tǒng)計第3、第4張蓮座葉上不同類型的表皮毛數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與Col-0相比，abt2突變體中表皮毛分支數(shù)顯著增加。在Col-0中，表皮毛主要以3個分支為主，約占表皮毛總數(shù)量的77.83%(第3張蓮座葉)、75.69%(第4張蓮座葉)，僅存在極少數(shù)5個分支的表皮毛；而在abt2突變體中，表皮毛主要以4、5個分支為主，4個分支的表皮毛約占葉片表皮毛總數(shù)量的60.55%(第3張蓮座葉)、61.19%(第4張蓮座葉)；5個分支表皮毛約占葉片表皮毛總數(shù)量的30.69%(第3張蓮座葉)、30.14%(第4張蓮座葉)，并且能觀察到一定數(shù)量的6個分支的表皮毛(第3張蓮座葉上為 2.42%，第4張蓮座葉上為1.66%)(圖1)。

2.2 abt2突變基因的定位

2.2.1abt2突變位點的遺傳分析 由于abt2突變體表皮毛發(fā)育缺陷表型非常明顯，所以期望通過圖位克隆分離突變基因，以進一步研究其調(diào)控表皮毛發(fā)育的機制。在進行圖位克隆之前，首先對abt2突變位點進行遺傳分析。通過將Col-0與abt2突變體進行正反交并觀察表皮毛表型，發(fā)現(xiàn)所獲得的F1代植株均表現(xiàn)野生型表皮毛表型，表明abt2突變體是細胞核基因控制的隱性突變體；F2代植株中野生型表型與突變體表型個體的分離比約為3 ∶1，符合孟德爾隱性單基因遺傳定律，從而說明abt2突變體的發(fā)育表型是由單基因控制的。

2.2.2abt2突變位點的粗定位 在確定了abt2突變體的遺傳特性之后，對abt2的突變位點進行粗定位。首先將Ler生態(tài)型植株與abt2突變體進行雜交，在F2代中挑選具有abt2表型的植株作為作圖群體，利用實驗室已有的均勻分布在擬南芥5條染色體的27個分子標(biāo)記(圖2)和由95株作圖群體植株的基因組DNA構(gòu)成的DNA池進行PCR擴增，根據(jù)與突變位點連鎖的分子標(biāo)記所擴增出條帶的遺傳背景偏向突變體來源的Col-0，而用于雜交的另一親本Ler條帶不能擴增或擴增量弱于對照的原理，發(fā)現(xiàn)突變位點與第4條染色體上分子標(biāo)記F20D10#1(17933942)連鎖較為緊密，說明突變位點可能位于該分子標(biāo)記附近(圖2)。

2.2.3 突變位點的精細定位 確定突變位點與染色體的連鎖關(guān)系后，為了進一步確定突變位點在染色體上所在的區(qū)間，以95個突變體DNA為模板，以F20D10#1(17933942)及在F20D10#1下方增加的新的分子標(biāo)記T5J17#1(18516022)為引物進行PCR擴增，結(jié)果(表1)顯示突變位點位于分子標(biāo)記F20D10#1和T5J17#1之間，所以將分子標(biāo)記F20D10#1和T5J17#1作為后續(xù)定位的側(cè)翼分子標(biāo)記(flanking marker)(圖3)。接著通過在Flanking marker區(qū)間內(nèi)增加新的分子標(biāo)記對abt2突變位點進行精細定位。利用1個新的dCAPS引物F20M13#3(18010126)和1個新的插入/刪除(In/Del)分子標(biāo)記T9A14#1(18053432)(表1)對F2作圖群體中475株突變體表型植株的基因型進行分析，最終將突變基因定位在分子標(biāo)記F20M13#3和T9A14#1的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間的物理距離為43 306 bp(圖3)。

表1 精細定位所用分子標(biāo)記

2.2.4 候選基因的篩選與確定 確定了abt2突變位點所在的區(qū)間后，利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫對該區(qū)間內(nèi)所覆蓋的全部基因進行分析，重點關(guān)注與表皮毛發(fā)育相關(guān)的基因。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)間內(nèi)基因At4g38600被報道與表皮毛發(fā)育有關(guān)。At4g38600基因也被稱為KAKTUS/UbiquitinProteinLigase3(KAK/UPL3)，編碼E3泛素蛋白連接酶，KAK基因的功能缺失會導(dǎo)致擬南芥蓮座葉上的表皮毛分支數(shù)顯著增加，與abt2突變體的表皮毛發(fā)育缺陷表型相似[14-15]。因此推測abt2突變體的表型很可能是由于KAK基因的功能缺失所導(dǎo)致的。為了驗證abt2是否為KAK的新等位基因，首先對abt2突變體背景中的KAK基因進行測序，發(fā)現(xiàn)在abt2突變體中KAK基因的第6 881 bp處發(fā)生了單堿基突變，由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)(圖4)， 這表明abt2 突變表型的產(chǎn)生很可能是由KAK基因的單堿基突變造成的，KAK可能就是abt2的突變基因。

2.2.5abt2和KAK基因間的遺傳互作分析 為了進一步確定KAK基因的突變是造成abt2突變表型產(chǎn)生的原因，利用KAK基因的功能缺失突變體SALK_037636對abt2和KAK基因之間的等位性進行分析。SALK_037636的突變表型是由于在KAK基因的第+1 241 bp處插入了T-DNA，導(dǎo)致KAK的表達量降低所造成的(圖5)。

將abt2與SALK_037636進行雜交并獲得了F1代植株，通過觀察F1代植株第3、第4張蓮座葉上的表皮毛發(fā)育表型，發(fā)現(xiàn)其與abt2和SALK_037636的表型相似，表皮毛分支數(shù)明顯增加(圖6)，這表明abt2基因突變與KAK基因突變不能互補彼此的突變表型，abt2的突變基因就是KAK，abt2是KAK的新等位基因。

3 討論與結(jié)論

特色遺傳材料的獲得是研究基因功能的強有力手段。為了獲得新的參與調(diào)控植物表皮毛發(fā)育的新因子，本試驗利用EMS高效誘變擬南芥gl2-3所建立的二次突變體庫進行了大規(guī)模的遺傳篩選。在此過程中獲得了1個蓮座葉上表皮毛分支數(shù)明顯增加的突變體，并將其命名為abt2。通過圖位克隆及遺傳互作分析，表明abt2的突變表型是由KAK基因的+6 881 bp處發(fā)生由鳥嘌呤到腺嘌呤的單堿基突變所造成的，abt2基因是KAK基因的一個新等位基因。同時也發(fā)現(xiàn)，盡管在abt2突變體背景中KAK基因發(fā)生了單核苷酸突變，但是該突變并未造成所編碼的相關(guān)氨基酸發(fā)生改變，因此為無義突變。該無義突變?nèi)绾卧斐闪薬bt2突變體表現(xiàn)出了顯著的表皮毛發(fā)育缺陷表型將是下一步研究的重點。另外，KAK是表皮毛核內(nèi)復(fù)制的抑制基因，KAK功能缺失突變體的蓮座葉表皮毛呈現(xiàn)過度分支的表型，并伴隨表皮毛細胞核DNA含量增加[16]，本試驗所獲得的abt2突變體為進一步研究KAK基因與表皮毛調(diào)控之間的關(guān)系提供了新的遺傳材料，也為深入研究KAK參與調(diào)控植物表皮毛發(fā)育的可能機制奠定了基礎(chǔ)。