王 飛

（河南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，河南 鄭州 450000）

長久以來，棉種的純度與真實(shí)性鑒定停留在一些傳統(tǒng)方法上，如田間種植鑒定法，其需要投入大量的物力、人力，且時(shí)效性差，易受人為和環(huán)境的影響，制約了對(duì)棉種的質(zhì)量管控。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用SSR分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行品種真?zhèn)闻c純度鑒定已成為發(fā)展趨勢(shì)，國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟在分子測(cè)試指南中，將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR[1]。

1 SSR分子標(biāo)記原理

SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列，Simple Sequence Repeat）是由幾個(gè)核苷酸組成的短序列首尾連接重復(fù)多次構(gòu)成，在作物DNA中串聯(lián)重復(fù)排列[2]。每個(gè)SSR側(cè)翼序列通常是同一作物品種中相對(duì)保守的單拷貝序列，由該序列可設(shè)計(jì)出一對(duì)互補(bǔ)寡聚核苷酸引物，再經(jīng)過SSR-PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物通過電泳檢測(cè)可顯示出不同品種間重復(fù)次數(shù)的差異。

2 研究進(jìn)展

2.1 檢測(cè)體系的優(yōu)化

SSR分子技術(shù)鑒定棉種的真實(shí)性和純度的一般步驟分為棉種DNA提取、PCR擴(kuò)增、PAGE凝膠電泳及銀染。在棉種DNA提取方法上，宋國立等[3]提出了改良的CTAB法，該法能夠較好地去除DNA中的棉酚、單寧等物質(zhì)。高文偉等[4]采用改良的SDS-CTAB法，不需要多次酚-氯仿抽提，得到了高質(zhì)量的棉花DNA，是一種高效簡(jiǎn)潔的DNA提取法。然而以上方法都是以棉花組織或葉片為試驗(yàn)材料，不能滿足鑒定要求的時(shí)效性?？锩偷萚5]開發(fā)了一種直接以棉籽為材料，只需兩次酚-氯仿-異戊醇抽提獲得棉種DNA的方法，其顯著提高了檢測(cè)的時(shí)效性。

在反應(yīng)條件上，田海燕等[6]指出，DNA純度、退火溫度(Tm)、鎂離子濃度是影響擴(kuò)增體系最關(guān)鍵的條件，而同一引物對(duì)于不同品種的退火溫度不同，且在退火溫度允許的范圍內(nèi)，較高的Tm可有效降低模板與引物之間的非特異性結(jié)合，增強(qiáng)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性[7]。經(jīng)過大量試驗(yàn)探索將擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性4 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸12 min，1個(gè)循環(huán)；4℃放置備用。

電泳檢測(cè)方法有3種，即瓊脂糖電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中，瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分辨度最低，大小100～300 bp，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳次之，而變性聚丙烯酰胺凝膠分辨率最低，可達(dá)1 bp[8]。非變性膠操作簡(jiǎn)單，但往往會(huì)檢測(cè)到雜合鏈，因此常檢測(cè)出假陽性譜帶；變性膠檢測(cè)出的是單鏈，沒有雜合鏈，條帶清晰，等位基因類型豐富，但是操作相對(duì)煩瑣[9]。對(duì)于品種差異性鑒定來說，存在較小差別的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳和非變性凝膠電泳較難分辨，只有變性膠凝膠電泳更適合品種差異性鑒定。鑒定材料從葉片發(fā)展到種子，適應(yīng)了檢測(cè)過程時(shí)效性的要求；PCR反應(yīng)參數(shù)和檢測(cè)平臺(tái)的優(yōu)化使得鑒定結(jié)果更加真實(shí)可靠。總之，試驗(yàn)體系的不斷改善，為棉種SSR分子檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

2.2 核心引物的篩選及應(yīng)用

核心引物篩選是棉種分子檢測(cè)技術(shù)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的一步，其也是構(gòu)建DNA標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的前提條件。在主要農(nóng)作物中，水稻和玉米制訂了DNA指紋方法的兩個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（《NYT 1432—2007玉米品種鑒定DNA指紋方法》和《NYT 1433—2007水稻品種鑒定 DNA指紋方法》)，并得到了廣泛應(yīng)用。然而棉花是常異花授粉異源四倍體作物[10]，自然混雜相對(duì)比較嚴(yán)重，其標(biāo)準(zhǔn)的制訂相較其他作物更為困難?？锩偷萚11]以32份棉花主栽品種為材料，對(duì)214對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，得到36對(duì)在染色體上分布均勻的核心引物，將差異位點(diǎn)大于或等于2個(gè)的樣品判定為雜株，并指出在品種鑒定上最少采用5對(duì)引物相組合即可將32個(gè)棉花品種完全區(qū)分開。付小瓊等[12]研究認(rèn)為，當(dāng)2個(gè)以上引物譜帶與其他樣品不一致時(shí)，則判定其為雜株，且田間性狀表現(xiàn)與SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果有較高吻合度。王飛等[13]采用52對(duì)核心引物對(duì)7個(gè)棉花品種進(jìn)行了SSR分析，初步將大于或等于3個(gè)差異位點(diǎn)的樣品判定為雜株，并對(duì)棉種中的非純位點(diǎn)現(xiàn)象進(jìn)行了分析。

筆者認(rèn)為，對(duì)于棉花雜株的SSR判定方法，要充分驗(yàn)證田間鑒定與DNA分子檢測(cè)的結(jié)果，將待測(cè)樣品中雜株的差異位點(diǎn)閾值限定在更精確范圍內(nèi)，以提高棉種純度分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性。而核心引物數(shù)量還需進(jìn)一步探討，品種純度檢測(cè)可以說是一個(gè)鑒別不同品種的過程，因此應(yīng)選擇能夠有效區(qū)分混雜種子的標(biāo)記。

3 問題與展望

棉種真實(shí)性和品種純度鑒定是確保種子質(zhì)量安全的重要手段之一。從棉種的遺傳物質(zhì)特性上，即利用SSR的多態(tài)性能夠?qū)ζ贩N間和同一品種內(nèi)遺傳變異進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。然而，在分子檢測(cè)真實(shí)性方法上還存在一些問題需要解決，例如真實(shí)性鑒定過程中差異位點(diǎn)閾值的問題，在《玉米品種真實(shí)性SSR鑒定技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定：若待測(cè)品種和標(biāo)準(zhǔn)品種至少需要比較20個(gè)單株的特征帶型，若兩份樣品相同譜帶的單株比例達(dá)到20%以上，則該位點(diǎn)無差異為真實(shí)品種，反之為假品種。在棉種分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)制定中，可參考玉米的鑒定規(guī)范，再結(jié)合棉花自身特性，探索出適用于主栽棉花品種的差異位點(diǎn)判定方法。

棉種真實(shí)性和純度分子檢測(cè)技術(shù)的完善還需借鑒其他作物的成功經(jīng)驗(yàn)，不斷探索總結(jié)?？傊琒SR檢測(cè)技術(shù)為棉花品種分子檢測(cè)方法開辟了一條全新路徑，為我國棉種質(zhì)量安全提供了可靠的技術(shù)保障。