楊迪 趙新仕 鄒婷婷 王赟 周業(yè)皓 杜戈

摘要：? 為建立‘楊氏金紅50號獼猴桃的離體快繁體系，該研究以其帶腋芽莖段為外植體，采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行離體培養(yǎng)，并建立了兩種離體再生途徑：途徑I為直接誘導(dǎo)莖段腋芽出芽;途徑Ⅱ?yàn)榍o段基部先產(chǎn)生愈傷組織，再分化不定芽。結(jié)果表明：‘楊氏金紅50號獼猴桃?guī)б秆壳o段的最佳滅菌方式為75%酒精30 s+ 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1%升汞8 min;在途徑I中，誘導(dǎo)莖段腋芽出芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA;在途徑Ⅱ中，誘導(dǎo)莖段基部產(chǎn)生愈傷組織并產(chǎn)生不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ 3.0 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA;培養(yǎng)叢生芽的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.4 mg·L-1 NAA;不定芽生根培養(yǎng)的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA，20 d左右分化出不定根，40 d左右獲得完整植株;生根后的組培苗在田園土∶細(xì)沙=1∶1的基質(zhì)中能達(dá)到96%的移栽成活率。-

關(guān)鍵詞： ‘楊氏金紅50號獼猴桃， 帶腋芽莖段， 組織培養(yǎng)， 植物生長調(diào)節(jié)劑， 再生體系-

中圖分類號：? Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2018）12-1667-08---

廣西植物38卷

12期

楊迪等： ‘楊氏金紅50號獼猴桃的離體快繁研究

收稿日期：? 2018-01-15-

基金項(xiàng)目：? 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（102102110159）;南陽師范學(xué)院2018年度STP項(xiàng)目（2018STP001）;南陽師范學(xué)院2017年度研究生創(chuàng)新基金（2017CX007） [Supported by the Scientific and Technological Research Program of Henan Province （102102110159）; STP Program of Nanyang Normal University in 2018 （2018STP001）; Graduate Student Innovation Fund of Nangyang Normal University in 2017 （2017CX007）]。-

作者簡介： 楊迪（1993-），男，河南南陽人，碩士研究生，從事植物資源保護(hù)與利用等研究，（E-mail）amazingdaliyang@163.com。-

*通信作者：? 張乃群，教授，從事植物資源保護(hù)與利用等研究，（E-mail）zhnq@nynu.edu.cn。

Micropropagation in vitro of Actinidia chinensis -‘Yangshi Jinhong 50

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YANG Di1， ZHAO Xinshi1， ZOU Tingting1， WANG Yun1， ZHOU Yehao1， -DU Ge2， LI Shulin2， ZHANG Naiqun1*

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（ 1. College of Life Sciences and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan， China;-2. Institute of Actinidia Chinese in Xixia County， Xixia 474573， Henan， China ）

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Abstract：? In order to establish the rapid and efficient propagation system in vitro， we used stem with axillary bud of Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50 as the explant， and used tissue culture to study suitable explants sterilization method， best plant growth regulator combination in Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50. We established two kinds of in vitro regeneration modes. Mode I： the axillary buds of stem with axillary bud were induced directly; Mode Ⅱ： the callus was induced first， and then the adventitious buds were induced. The results showed that the best sterilization method for stems with axillary buds was 75% alcohol 30 s + 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1% mercuric chloride 8 min; In Mode I， the plant growth substances combination of MS + 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA for axillary bud germination had the best the induction rate; In Mode Ⅱ， callus rate of inducing stem bottom was more than 80%， the optimal medium that induced stems bottom callus to generate adventitious buds was MS+ 3.0 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA; the best plant growth substances combination in tufted bud culture was MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.4 mg·L-1 NAA; the best plant growth substances combination in rooting culture was 1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA， getting the differentiation of adventitious root about 20 d and complete plant 40 d. After the seedlings rooted， transplanted the seedlings to the substrate， the seedlings reached the 96% survival rate in the substrate with the garden soil∶sand = 1∶1. Through this study， the micropropagation system in vitro of Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50 was established， which provides the basis for the research of genetic transformation in Actinidia chinensis Planch.-

Key words： Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50， stems with axillary buds， tissue culture， plant growth regulator， regeneration system

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獼猴桃作為20世紀(jì)人工馴化栽培野生果樹最有成就的四大果種之一（Warrington & Weston，1990），其莖段（王林青，2017）、花藥（王廣富，2017）、葉片（韋鵬飛，2016）、葉柄（葛新玲，2009）、胚乳（林穎等，2012）等都曾被用作組織培養(yǎng)的研究，組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為獼猴桃良種繁育的重要途徑。

中華獼猴桃（Actinidia chinensis）是中國特有的獼猴桃果種，口感獨(dú)特，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，近年來種植規(guī)模逐步擴(kuò)大（王茹琳等，2018）?！畻钍辖鸺t50號獼猴桃（Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50）是2013年由江蘇省揚(yáng)州楊氏獼猴桃科學(xué)研究所從中華獼猴桃中選育出來的優(yōu)良品種，果實(shí)單果重量平均在100 g以上，金肉紅心，不僅好看而且甜度高、果肉細(xì)膩、口感好，被認(rèn)為是有望超越‘海沃德的新品種。西峽縣是中國重要的獼猴桃產(chǎn)區(qū)，種植了大量的‘楊氏金紅50號獼猴桃且銷量好、農(nóng)戶評價(jià)較高、市場前景廣闊?，F(xiàn)階段西峽縣采用的育苗方法主要為實(shí)生苗嫁接法，即以種子繁育的實(shí)生苗為砧木，在其上嫁接人工栽培品種。該方法需先利用一年時(shí)間培育出實(shí)生苗作為砧木，然后再利用一年時(shí)間管護(hù)嫁接苗生長，育苗周期為兩年左右（唐玲玲等，2016），時(shí)間長且易感染潰瘍病，對西峽縣的獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展有一定限制。目前，雖然關(guān)于獼猴桃組織培養(yǎng)有一定的報(bào)道，但獼猴桃雌雄異株，基因高度雜合，組織培養(yǎng)體系受到基因型的影響（黃宏文等，2000），且關(guān)于‘楊氏金紅50號的組織培養(yǎng)尚未見有相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究采用楊氏金紅50號獼猴桃的帶腋芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)，為西峽縣科學(xué)種植‘楊氏金紅50獼猴桃提供了技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料在西峽縣獼猴桃研究所試驗(yàn)田采集，取材時(shí)間為5月，取健康、幼嫩的‘楊氏金紅50號獼猴桃新梢莖段為外植體。

1.2 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件

腋芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、芽的分化、叢生芽培養(yǎng)均以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，含36 g·L-1蔗糖、6 g·L-1瓊脂、pH為5.8～6.2之間，用到的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、IBA，培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為每天12 h左右。

1.3 方法-

1.3.1 外植體的滅菌將‘楊氏金紅50號獼猴桃的幼嫩枝條去除葉片，用洗潔精洗凈，并在自來水下沖洗40 min，截成1～1.5 cm長的帶腋芽莖段，再分別用4個處理進(jìn)行滅菌。每個處理接種30個，21 d時(shí)分別統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、成活率。成活率=1-污染率-褐化率。滅菌后的帶腋芽芽莖段用無菌水沖洗5～6次，洗去滅菌劑殘留和滅菌過程中莖段的分泌物，每個處理接種30個外植體。由于‘楊氏金紅50號獼猴桃莖段表層長有細(xì)密的毛，滅菌處理時(shí)應(yīng)用無菌鑷子反復(fù)攪動，以便于滅菌劑充分接觸莖段表皮。-

1.3.2 腋芽培養(yǎng)經(jīng)滅菌處理的帶腋芽莖段需先剪去兩端與滅菌劑接觸的傷口部分，再分別接種于添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，腋芽朝上，培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)腋芽的萌發(fā)率及數(shù)量。共設(shè)9種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基8個外植體，重復(fù)3次。出芽率=出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)SymboltB@100%。-

1.3.3 愈傷組織不定芽誘導(dǎo)在腋芽誘導(dǎo)的過程中，莖段基部會產(chǎn)生愈傷組織，每隔一周觀察記錄一次每種培養(yǎng)基莖段愈傷組織的變化情況，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織再分化成芽的誘導(dǎo)率。愈傷組織再分化成芽的誘導(dǎo)率（表3中的出芽率）=愈傷組織出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)SymboltB@100%。-

1.3.4 叢生芽培養(yǎng)選擇健壯且生長狀況基本一致的單個不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上做叢生芽培養(yǎng)，每隔10 d觀察一次芽的生長情況，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖率及增殖系數(shù)。共設(shè)9種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基7個不定芽，重復(fù)3次。增殖系數(shù)為單個外植體再生形成的芽的平均數(shù)。-

1.3.5 不定芽生根選取長至2～3 cm且健壯、生長情況基本一致的單個不定芽接種于生根培養(yǎng)基上做生根培養(yǎng)。共設(shè)6種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基7個不定芽，重復(fù)3次，每隔10 d觀察記錄一次數(shù)據(jù)。生根率=生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)SymboltB@100%。-

1.3.6 生根苗移栽生根后的無菌苗，移至在日光溫室中煉苗，先擰松瓶蓋放置2 d，再打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，放置5 d左右，之后洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至田園土∶細(xì)沙= 1∶1的基質(zhì)中。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)先用Excel 2013做初步統(tǒng)計(jì)，再用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，平均數(shù)之間差異顯著性比較采用Duncan法（新復(fù)極差法）。

2結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法獲取‘楊氏金紅50號獼猴桃無菌帶芽莖段

經(jīng)過20 d的觀察，污染多出現(xiàn)在前9 d，褐化則是在7～20 d之間陸續(xù)出現(xiàn)，4種滅菌方法對‘楊

氏金紅50號獼猴桃?guī)а壳o段的處理效果有較大的差異，如表1所示。C處理僅用Ca（ClO）2滅菌，污染率最高，達(dá)到70.00%，成活率最低，而另外3種使用升汞的處理污染率均在50%以下，說明本試驗(yàn)中升汞滅菌效果更好;A處理是升汞滅菌5 min，B處理是升汞滅菌8 min，A處理污染率比B處理高13.34%，成活率低10.02%，說明升汞滅菌

8 min效果比5 min好;D處理是Ca（ClO）2和升汞結(jié)合滅菌，污染率比B處理低10.00%，成活率高3.24%，效果略優(yōu)。外植體褐化現(xiàn)象是由外植體被切割后，破裂溶酶體中的酚氧化酶把細(xì)胞質(zhì)中的酚氧化為醌產(chǎn)生的。綜合考慮，‘楊氏金紅50號獼猴桃?guī)а壳o段滅菌的最佳處理為75%酒精30 s+ 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1%升汞8 min。

2.2 ‘楊氏金紅50號獼猴桃腋芽的誘導(dǎo)

帶腋芽莖段接種后，培養(yǎng)7 d左右腋芽開始萌發(fā)，13 d左右可看到明顯的呈淺綠色的小芽，隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，腋芽逐漸變成深綠色，35 d后，最高的出芽率達(dá)91.67%（表2），芽的高度在2～5 cm之間。由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA濃度為3～5 mg·L-1時(shí)，0.1 mg·L-1的NAA濃度最適合腋芽萌發(fā)，3種培養(yǎng)基中外植體的腋芽出芽率均在75%及以上。其中，2號培養(yǎng)基中外植體出芽率高達(dá)91.67%，顯著高于其余8種培養(yǎng)基，且芽健壯，莖、葉明顯，生長旺盛（圖1：A）;6號培養(yǎng)基中外植體的出芽率達(dá)79.17%，苗弱、細(xì)，葉片長勢很好，莖短，不能正常伸長;從整體上來看，隨著NAA濃度由0.1 mg·L-1升至0.3 mg·L-1，對腋芽的出芽有抑制作用。因此，本研究得到的‘楊氏金紅50號獼猴桃莖段腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA。

2.3 ‘楊氏金紅50號獼猴桃莖段基部愈傷組織的不定芽分化

9種培養(yǎng)基中接種的‘楊氏金紅50號獼猴桃莖段基部均能大量形成愈傷組織（圖1：B），出愈率均在80%以上，但愈傷組織再分化成不定芽的過程較慢，前7 d外植體底端明顯膨大，7～15 d之間形成愈傷組織，1月后愈傷組織才能再分化出芽，在1～3個月之間愈傷組織會陸續(xù)長出不定芽。其中，7號培養(yǎng)基，即3 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1

NAA出芽最快，出芽率最高，出芽時(shí)間在前2個月，出芽率達(dá)83.33%，芽粗壯，長勢良好（圖1：C）;而1號培養(yǎng)基，即3 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA，出芽率雖然也高達(dá)75.00%，但整體出芽時(shí)間多為第2個月和第3個月，屬后期出芽;其余

7種培養(yǎng)基出芽率與上述兩種差異顯著（P<0.05）。結(jié)合表3可知，6-BA和NAA的濃度配比對莖段愈傷組織的誘導(dǎo)情況及愈傷組織再分化成芽的誘導(dǎo)率影響顯著，NAA濃度不變時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織產(chǎn)生不定芽的誘導(dǎo)率呈下降趨勢，6-BA濃度為5 mg·L-1時(shí)，出愈率雖然高，但出芽率卻極低，6號培養(yǎng)基除少量芽分化外還有少量不定根分化，9號培養(yǎng)基的出芽率為0。因此，‘楊氏金紅50號獼猴桃莖段愈傷組織誘導(dǎo)及再分化形成不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+ 3 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA。

2.4 ‘楊氏金紅50號獼猴桃叢生芽培養(yǎng)

在叢生芽培養(yǎng)過程中，8 d左右在芽底部的莖上會先長出少量愈傷組織，在愈傷組織上會出現(xiàn)芽點(diǎn)，13～17 d便可觀察到叢生芽的長出。根據(jù)表4可知，5號培養(yǎng)基的增殖效果最好，平均增殖系數(shù)達(dá)6.14（圖1：D），與其余的培養(yǎng)基有極顯著差異（P<0.01）;8號培養(yǎng)基平均增殖系數(shù)為5.10，比5號培養(yǎng)基稍差一點(diǎn);7號培養(yǎng)基最差，只有個別不定芽增殖。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在NAA濃度不變時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，增值系數(shù)出現(xiàn)“低- 高- 低”的變化，可見，6-BA濃度為 4.0 mg·L-1適合‘楊氏金紅50號獼猴桃叢生芽培養(yǎng)，相匹配的3種NAA濃度，0.4 mg·L-1時(shí)效果最佳。所有培養(yǎng)基在植株的基部均有愈傷組織的形成，3、6、9號培養(yǎng)基基部的愈傷團(tuán)較大;3、6號培養(yǎng)基共出現(xiàn)3個玻璃化芽;1號培養(yǎng)基增殖的不定芽顏色偏黃，長勢畸形。因此，‘楊氏金紅50號獼猴桃的最佳叢生芽培養(yǎng)基為MS+4 mg·L-1 6-BA+0.4 mg·L-1 NAA。

2.5 ‘楊氏金紅50號獼猴桃不定芽的生根

不定芽在生根培養(yǎng)基中，12 d左右在芽底部的莖上出現(xiàn)根點(diǎn)，從第18天開始產(chǎn)生不定根，第22天普遍生根，之后不定根伸長，在40 d左右形成良好的根系。根據(jù)表5可以看出隨著IBA濃度的升高，‘楊氏金紅50號獼猴桃不定芽的生根情況有顯著差異。除3號培養(yǎng)基外，整體培養(yǎng)基的生根率、平均生根數(shù)、平均根長均隨著IBA濃度升高而變化，在0.9 mg·L-1 IBA處理時(shí)達(dá)到最大值，株高則隨著IBA濃度升高而降低。0.9 mg·L-1 IBA處理的生根率最高（72.64% ）、平均生根數(shù)較多（25.67條 ）、根

長較長（2.67 cm ）（圖1：E），其次是1.1 mg·L-1 IBA處理，0.3、0.7 mg·L-1 IBA處理兩個處理生根率還不到40%，平均生根數(shù)及根長亦較差。因此，‘楊氏金紅50號獼猴桃不定芽最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA。

2.6 生根苗移栽

生根苗經(jīng)1周左右的煉苗，移栽至配好的基質(zhì)中，再經(jīng)40 d的觀察，成活率達(dá)到96%以上，根系發(fā)達(dá)，適合進(jìn)行田園種植（圖1：F）。

3討論

激素的配比對組織培養(yǎng)起著決定性的作用，不同種類或濃度的激素對外植體生長和分化有不同的作用（黃奧丹等，2017;閆海霞等，2017）。關(guān)于誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，前人的研究不盡相同。同為中華獼猴桃系列品種的‘紅陽獼猴桃的最佳激素組合為1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌發(fā)率達(dá)83.33%（隆前進(jìn)等，2010）;‘臍紅獼猴桃的最佳激素組合為2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌發(fā)率達(dá)82.64%（王林青，2017）;‘Hort 16A獼猴桃的最佳激素組合為3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌發(fā)率達(dá)85.15%（王林青，2017）;本試驗(yàn)利用較高濃度的6-BA和較低濃度的NAA結(jié)合，腋芽萌發(fā)率為91.67%，高于上述三個品種，這可能是因?yàn)榛蛐偷牟煌?，?dǎo)致不同品種所適應(yīng)的激素濃度也不同。此外，還發(fā)現(xiàn)莖段基部易產(chǎn)生愈傷組織，再分化出不定芽時(shí)，6-BA對其影響明顯，3.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA時(shí)出芽率達(dá)83.33%，誘導(dǎo)過程不需更換培養(yǎng)基，這與常用的先用2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織，再用6-BA或ZT結(jié)合NAA誘導(dǎo)不定芽（張?zhí)龋?017）更省時(shí)省力，這可能是由于‘楊氏金紅50號獼猴桃本身長勢較好。關(guān)于叢生芽培養(yǎng)，劉崢等（2013）在總結(jié)獼猴桃組織培養(yǎng)研究進(jìn)展時(shí)認(rèn)為高濃度的6-BA對獼猴桃的不定芽增殖有促進(jìn)作用，卻會抑制莖的伸長。本研究得出叢生芽培養(yǎng)階段最佳的6-BA使用濃度為4.0 mg·L-1，屬于較高濃度，發(fā)現(xiàn)接種的不定芽雖有較高的增殖系數(shù)，但卻出現(xiàn)葉片生長過旺，莖生長緩慢的現(xiàn)象，不利于進(jìn)一步的生根培養(yǎng)，這與劉崢等（2013）的觀點(diǎn)類似，具體原因有待于進(jìn)一步試驗(yàn)探索。誘導(dǎo)不定芽生根時(shí)， 吳秀

華等（2013）通過比較NAA、IBA對‘海沃德獼猴桃生根的影響，得出IBA效果更優(yōu)的結(jié)論;趙許朋等（2013）僅用IBA誘導(dǎo)‘紅陽獼猴桃生根，也取得了很好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)合適的IBA濃度可有效促進(jìn)‘楊氏金紅50號獼猴桃生根，其作用只在一定范圍內(nèi)有效。

本研究采用兩種途徑獲得‘楊氏金紅50號獼猴桃的無菌苗：一是誘導(dǎo)帶芽莖段腋芽萌發(fā)，二是誘導(dǎo)莖段基部形成愈傷組織并產(chǎn)生不定芽。在已有的研究中，中華獼猴桃（譚曉明，2002）、軟棗獼猴桃（林苗苗等，2016;牛曉林，2012）、狗棗獼猴桃（張玉杰，2014）成功構(gòu)建了這兩種途徑的快繁體系;葛棗獼猴桃（王羽悅，2016）則通過帶芽莖段腋芽萌發(fā)的途徑建立了快繁體系;而大籽獼猴桃（姜維梅和李鳳玉，2003）的愈傷組織分化成苗困難。上述研究均指出誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的快繁途徑比通過莖段基部愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的快繁途徑更節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間，效率更高，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)需35 d左右，而通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的方式需2～3個月，時(shí)間過長。胡科迪（1991）用獼猴桃嫩梢為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，指出誘導(dǎo)帶芽莖段腋芽萌發(fā)的途徑在遺傳性狀上更穩(wěn)定，可保持母株優(yōu)良性狀，愈傷組織在分化過程中出現(xiàn)變異的可能性大。因此，直接誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的快繁途徑是‘楊氏金紅50號獼猴桃組培快繁的有效途徑，通過愈傷組織產(chǎn)生的不定芽可為遺傳轉(zhuǎn)化研究提供基礎(chǔ)。

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