劉育辰 劉麗蘋 劉剛 金文淵 龍毅 黃明喆 楊欣

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）12-1636-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.12

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定苗藥黑骨藤中綠原酸和杠柳毒苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Xtimate C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)藥材樣品中綠原酸和杠柳毒苷的含量進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：綠原酸、杠柳毒苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8 μg（r=0.999 4）、0.016 8～2.3 μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于5.0%；定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL；加樣回收率分別為102.66%～104.00%（RSD=0.53%，n=6）、96.44%～100.79%（RSD=1.73%，n=6）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于3.0%。18份藥材樣品可聚為三大類，即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。結(jié)論：該方法可用于黑骨藤藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)；不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞 黑骨藤；綠原酸；杠柳毒苷；含量測(cè)定；聚類分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of chlorogenic acid and periplocin in Miao medicine Periploca forrestii. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Xtimate C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was maintained at 25 ℃. The sample size was 10 μL. Cluster analysis was conducted according to the content of chlorogenic acid and periplocin in samples by SPSS 23.0 software. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid and periplocin were 0.040 6-1.8 μg（r=0.999 4） and 0.016 8-2.3 μg（r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 5.0%. The quantitation limits were 0.918 0， 0.084 3 μg/mL， and detection limits were 0.102 0， 0.025 3 μg/mL， respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The recoveries were 102.66%-104.00%（RSD=0.53%，n=6）， 96.44%-100.79%（RSD=1.73%，n=6），respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The result indicated that 18 batches of samples were divided into 3 categories by cluster analysis. S2， S4， S10， S12 and S14-S18 were divided into one category； S1， S3， S5-S7， S9， S11 and S13 were divided into another category； S8 was regarded as one category. CONCLUSIONS： The method can be applied for quality control and evaluation of P. forrestii. The contents of chlorogenic acid and periplocin in P. forrestii from different producing areas are different greatly. There is a certain correlation between the content of each component and the producing area.

KEYWORDS Periploca forrestii； Chtorogenic acid； Periplocin； Content determination； Cluster

黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，又名飛仙藤、黑骨頭、柳葉過(guò)山龍、滇杠柳等，苗語(yǔ)稱嘎八又賒、銳松怪、蛙蟒塞，其味苦，辛、溫，有小毒，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)之功效，多用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、乳腺炎、閉經(jīng)等病癥。主要分布在貴州、云南、廣西、西藏等地，生長(zhǎng)于2 500米以下山地疏林向陽(yáng)處、陰濕雜木林下及灌木叢中[1-2]。

黑骨藤藥材通常為野生，無(wú)規(guī)范種植基地，藥材質(zhì)量難以控制，目前仍執(zhí)行的是2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[3]，此標(biāo)準(zhǔn)中只有來(lái)源、性狀、顯微鑒別和理化鑒別等傳統(tǒng)項(xiàng)目。研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤藥材含有黃酮類[4]、香豆素類[5]、強(qiáng)心苷類[6]、三萜類[6]、酚酸類[7]、C21甾類[4]、神經(jīng)酰胺類[8]等多種成分，但目前其含量測(cè)定主要集中于總皂苷[9]、總黃酮[10]、黃酮苷[11]、強(qiáng)心苷[12]等單一指標(biāo)。藥理實(shí)驗(yàn)證明，黑骨藤藥材中咖啡酰基奎寧酸類成分和滇杠柳苷類成分分別具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]和強(qiáng)心作用[14]。因此，本研究以上述兩類活性成分的代表綠原酸和杠柳毒苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)貴州省不同產(chǎn)地的黑骨藤藥材中兩種成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行聚類分析，以便更全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate-3000 型HPLC儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、二級(jí)管陣列檢測(cè)器和Chromeleon 色譜工作站[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；DRHH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Q-2508型高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；JT1003型電子分析天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16031610，純度：>98%）、杠柳毒苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16072202，純度：>98%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

18份藥材樣品采自貴州省不同產(chǎn)地（見(jiàn)表1），經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院劉剛實(shí)驗(yàn)師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，9%→10% A；12～30 min，10%→21% A；30～50 min，21%→35% A；50～60 min，35%→70% A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸對(duì)照品5.08 mg，置于5 mL量瓶中，以流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.016 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液；精密稱取杠柳毒苷對(duì)照品8.40 mg，置于10 mL量瓶中，以流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.840 mg/mL的杠柳毒苷對(duì)照品溶液。再精密量取上述綠原酸對(duì)照品溶液2 mL、杠柳毒苷對(duì)照品溶液1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成綠原酸、杠柳毒苷質(zhì)量濃度分別為0.040 6、0.016 8 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末2.0 g，按料液比1 ∶ 25加入70%乙醇溶液50 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，于70 ℃水浴蒸干，加25 mL水使成混懸液，分別依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次，將3次正丁醇萃取液合并，濃縮至干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至10 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按綠原酸、杠柳毒苷峰計(jì)應(yīng)大于5 000；保留時(shí)間分別為17.2、46.0 min，表明基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、14、20、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸、杠柳毒苷回歸方程分別為y=36.258x-0.765 8（r=0.999 4）、y=19.240x-0.269 5（r=0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸、杠柳毒苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 6～1.8、0.016 8～2.3 μg。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷定量限分別為0.918 0、0.084 3 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.102 0、0.025 3 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為0.16%、1.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）8份，分別于室溫下放置1、3、5、9、12、15、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷峰面積的RSD分別為4.15%、1.34%（n=8），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.230 8、0.062 2 mg/g，RSD分別為 4.17%、2.41%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量藥材樣品（編號(hào)：S1）6份，每份1 g，分別加入綠原酸、杠柳毒苷對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 流速考察 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S2）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.232 4、0.062 1 mg/g，RSD分別為2.54%、1.70%，表明流速一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 柱溫考察 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S2）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（柱溫分別為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、杠柳毒苷含量平均值分別為0.231 5、0.061 0 mg/g，RSD分別為0.90%、2.70%，表明柱溫一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取18份藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.12 聚類分析

以各共有峰相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)藥材樣品進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以?shī)A角余弦作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，聚類譜系中，將18份藥材樣品聚為三大類：即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，S8為一類。

3 討論

由表3可知，藥材樣品中綠原酸含量為0.047 1～0.376 0 mg/g，貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品中綠原酸含量最低，安順市產(chǎn)藥材樣品中綠原酸含量最高；杠柳毒苷含量為0.016 1～0.485 2 mg/g，貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品中杠柳毒苷含量最低，安順市產(chǎn)藥材樣品中杠柳毒苷含量最高。從各地區(qū)藥材樣品2種成分含量上來(lái)看，綠原酸和杠柳毒苷含量似有所關(guān)聯(lián)，即貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)相思河產(chǎn)藥材樣品上述2種成分含量均最低，而安順市產(chǎn)藥材樣品上述2種成分含量均最高，綠原酸含量?jī)僧a(chǎn)地藥材樣品相差約8倍，杠柳毒苷含量?jī)僧a(chǎn)地藥材樣品相差約30倍。筆者采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黑骨藤藥材生長(zhǎng)對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境的選擇性非常強(qiáng)，它喜歡生長(zhǎng)在向陰、水分充足的密林中。而安順市藥材產(chǎn)地環(huán)境恰恰符合上述特點(diǎn)。

聚類分析結(jié)果表明，綠原酸和杠柳毒苷含量與黑骨藤藥材的產(chǎn)地具有一定的聯(lián)系。18份藥材樣品主要聚為三大類，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚為一類，它們所處地理位置均在貴陽(yáng)市以北區(qū)域；S2、S4、S10、S12、S14～S18聚為一類，它們所處地理位置基本在貴陽(yáng)市以南區(qū)域；而自成一類的S8，其所處地理位置也在貴陽(yáng)市以南區(qū)域。

綜上所述，本方法可用于黑骨藤藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)；不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中綠原酸和杠柳毒苷的含量有較大差異，各成分含量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)。本結(jié)論為該藥材最佳產(chǎn)地的確定奠定了一定基礎(chǔ)，有助于指導(dǎo)藥材種植及采收。

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（收稿日期：2017-11-29 修回日期：2018-01-03）

（編輯：張 靜）