白俊其 蘇賀 黃娟 宮璐 李西文 徐江 黃志海 丘小惠

摘要 目的：研究化學(xué)指紋圖譜及DNA條形碼分子鑒定技術(shù)在肉桂精準(zhǔn)煮散飲片質(zhì)量體系的應(yīng)用。方法：應(yīng)用psbA-trnH序列作為DNA條形碼對肉桂進行鑒定；采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法，比較原飲片及不同規(guī)格煮散飲片的出膏率。建立肉桂HPLC指紋圖譜，測定指標(biāo)成分肉桂酸、肉桂醛的含量，同時標(biāo)定指紋圖譜共有峰，比較各樣品共有峰相對峰面積及相似度評價。結(jié)果：psbA-trnH序列對肉桂藥材可實現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定；精準(zhǔn)煮散飲片平均出膏率及煎煮液中指標(biāo)成分肉桂酸、肉桂醛含量略高于原飲片，且含量差異性明顯減小，RSD從原飲片的5.19%、26.80%降低為0.36%、0.42%。10個共有峰相對峰面積均有所升高，均一性明顯提高。結(jié)論：肉桂精準(zhǔn)煮散飲片可提高原飲片的煎煮效率及均一性。

關(guān)鍵詞 肉桂；精準(zhǔn)煮散飲片；DNA條形碼；質(zhì)量體系

Abstract Objective：To study the application of precise powder decoction pieces （PPDP） of Cinnamonum cassia Presl （CCP） with chemical fingerprint chromatography and DNA molecular identification technology were used on quality system. Methods： PsbA-trnH sequence was used as DNA barcode to indentify CCP. Different specifications of PPDP were prepared， and their dry extract content rates were compared with that of original slices. HPLC fingerprint of CCP was established and the contents of cinnamic acid and cinnamic aldehyde were measured. Common peak of fingerprint was demarcated. The common peak relative peak areas and similarity evaluation of each sample were compared. Results： CCP could be accurately identified by psbA-trnH sequences. The extract rate of the concentration of cinnamic acid and cinnamic aldehyde of PPDP were slightly higher than that of the original pieces， and the content differences decreased significantly. RSD of inter-assay dissolution of cinnamic acid and cinnamic aldehyde of the original slices were 5.19% and 26.80%， respectively， which could be reduced to 0.36% and 0.42% after mixing and preparing into PPDP. The relative peak areas of the 10 common peaks were increased， and uniformity was significantly improved. Conclusion： The precise powder decoction pieces of CCP can improve the extraction efficiency and uniformity of original slices.

Key Words Cinnamonum cassia Presl； Precise powder decoction pieces （PPDP）； DNA bar code； Quality system

中圖分類號：R284文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.055

肉桂為樟科植物肉桂Cinnamonum cassia Presl的干燥樹皮。歷代本草中均列為上品，具有補火助陽，引火歸源，散寒止痛，活血通經(jīng)等作用[1]。中醫(yī)作為治陽痿，宮冷，腰膝冷痛，腎虛作喘，陽虛眩暈，目赤咽痛，心腹冷痛，虛寒吐瀉，寒疝，奔豚，經(jīng)閉，痛經(jīng)藥使用。

肉桂主要含揮發(fā)油，多糖，倍半萜及其糖苷類化合物[1-5]，桂皮醛是肉桂的主要活性成分，也是《中華人民共和國藥典》2015版（一部）（簡稱《藥典》）含量測定項下所規(guī)定的指標(biāo)性成分?！端幍洹分袑θ夤痫嬈谥频拿枋鰞H為“用時搗碎”，導(dǎo)致臨床上肉桂飲片的規(guī)格差別較大。市售肉桂有5種商品規(guī)格[6]，即企邊桂、桂心、板桂、桂通（官桂）、桂碎。徐洋洋等[7]的實驗結(jié)果表明，企邊桂中桂皮醛含量最高，且各規(guī)格的肉桂含量差異較大，相差3倍左右。中藥材飲片批間、批內(nèi)質(zhì)量不均一，直接影響臨床用藥療效。因此，我們提出“精準(zhǔn)煮散飲片”的概念與思路方法，其實質(zhì)是通過標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工藝將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，實現(xiàn)了準(zhǔn)確、高效的自動化分裝、調(diào)劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的穩(wěn)定有效。

我們以肉桂為例，以DNA分子鑒定技術(shù)為鑒別手段，以飲片規(guī)格、出膏率、含量均一性、指紋圖譜及相似度評價為研究對象，對肉桂精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量體系進行評價，以期揭示精準(zhǔn)煮散飲片應(yīng)用的優(yōu)勢，為實現(xiàn)中藥飲片的質(zhì)量均一化，實現(xiàn)生產(chǎn)和配給的標(biāo)準(zhǔn)化、自動化，提高中醫(yī)臨床療效的有效穩(wěn)定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國waters 2695型，Empower色譜工作站，四元泵，自動進樣器及W2998 DAD檢測器）；Buchi R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；BT 125D十萬分之一分析天平（德國賽多利斯），粉碎機（臺灣榮聰鐵工廠）；2720 Thermal Cycler PCR儀（美國Applied Biosystems）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；1-14小型離心機（德國，Sigma）；MX-RL-E型混合儀（大龍興創(chuàng)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物

肉桂酸（含量≥98%，批號：B20162），購于上海源葉生物科技有限公司；肉桂醛（含量98.6%，本實驗室自制）；肉桂市售飲片分別購自康美藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：廣西，批號：160307991，160900871），及嶺南中藥飲片有限公司（產(chǎn)地：廣西，批號：1605001）經(jīng)本實驗室黃志海主任中藥師鑒定均為現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》（一部）肉桂項下收載品種。乙腈、甲酸均為色譜純（Fisher公司）；超純水由Millipore制得；DP305植物組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，中國）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，T818979）；Tris、β-巰基乙醇、瓊脂（美國，sigma，V900483、M6250、V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，2×Tap PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片制備

取肉桂飲片（批號：160307991），粉碎后過篩，得到5～10目（2～4 mm）、10～24目（0.8～2 mm）、24～65目（0.25～0.8 mm）等不同粒徑范圍的煮散飲片，用于出膏率比較。另取3個批次肉桂飲片各200 g，充分混合后，粉碎，過篩，取10～65目粒徑范圍的煮散飲片。不同批次原飲片各取50 g（S1：批號：160307991，S2：批號：160900871，S3：批號：1605001）；混合后10～65目肉桂煮散飲片，均勻攤平，畫格分為9份，隨機選取3份（S4～S6），從每份中分別稱取50 g，用于質(zhì)量均一性研究。原飲片及煮散飲片形態(tài)見圖1。

2.2 DNA條形碼的建立

選取肉桂飲片樣本約40 mg，采用改進的CTAB法提取肉桂基因組DNA。psbA-trnH序列擴增采用正向引物PA：5′-GTTATGC ATGAACGTAATGCTC-3′，反向引物：TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAA TCC-3′，進行擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶12.5 μL，正向、反向引物各1 μL（2.5 μmol/L），模板DNA 2.0 μL（30～100 ng），加ddH2O補足至25 μL。擴增程序：95 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min（35個循環(huán)）；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測序公司進行雙向測序。

應(yīng)用MEGA6.06分析3條肉桂psbA-trnH序列特征，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)無變異位點，3條肉桂序列比對后長度為421 bp。BLAST搜索結(jié)果均顯示相似性最高的為肉桂Cinnamomum aromaticum，相似度為100%，主導(dǎo)單倍型序列特征見圖2。

2.3 出膏率考察

分別稱取2.1項下原飲片及不同粒徑范圍煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法[15]進行提取。分別加8倍量水，浸泡30 min，煮沸后保持30 min，過濾，濾渣再加7倍量水煎煮30 min。合并過濾液，減壓旋蒸至100 mL，即濃縮為相當(dāng)于肉桂飲片1 g/mL的藥液。精密量取25 mL溶液，蒸干，得干浸膏質(zhì)量，計算出膏率。出膏率考察結(jié)果表明，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率有所提高，不同粒徑煮散飲片間出膏率無顯著性差異。我們后續(xù)實驗選10～65目為精準(zhǔn)煮散飲片，結(jié)果見表1。

2.4 質(zhì)量均一性考察

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Welch ODS-3 C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（5%→50%）；流速：1 mL/min，檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；洗脫時間：28 min；進樣體積：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取肉桂酸、肉桂醛對照品適量，加甲醇分別配制成含肉桂酸、肉桂醛1 mg/mL的對照品溶液，肉桂酸對照溶液依次稀釋成500、250、125、62.5、15.625、7.8125 μg/mL，肉桂醛對照溶液依次稀釋成200、100、50、25、12.5及6.25 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備

2.1項下6份樣品按2.3項下方法煎煮，合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g/mL的原藥材溶液，精密量取適量飲片提取液，用水稀釋成相當(dāng)于肉桂飲片0.02 g/mL的樣品供試品溶液，進樣前用0.22 μm濾膜過濾。

2.4.4 專屬性實驗

將對照品溶液及供試品溶液按2.4.1項下色譜條件進行進樣，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下肉桂酸、肉桂醛分離度良好，對照品及提取液色譜圖見圖3。

2.4.5 線性關(guān)系考察

將2.4.2項下已配置好的對照品溶液，按2.4.1項下的色譜條件進行檢測，以對照品峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，回歸方程為：肉桂酸（254 nm），Y=22 794X-29 566（R=0.999 8），肉桂醛Y=33 230X-96 906（R=0.999 9），表明肉桂酸、肉桂醛分別在7.812 5～500 μg/mL及6.25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.6 精密度試驗

取“2.4.2”項下已配置好的對照品溶液，按“2.4.1”項下各指標(biāo)成分色譜條件，重復(fù)進樣5次，計算肉桂酸、肉桂醛5次進樣峰面積的RSD值。肉桂酸、肉桂醛的RSD分別為0.35%，0.98%，提示儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.4.3”項下供試品溶液室溫下密封保存，于0，2，4，8，12，24 h取樣，按“2.4.1”項下各指標(biāo)成分色譜條件進行測定。肉桂酸、肉桂醛的RSD分別為0.92%，1.06%，提示樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性實驗

按“2.4.3”項下供試品溶液制備方法及樣品處理方法，重復(fù)制備5份樣品，按“2.4.1”項下各指標(biāo)成分色譜條件進行測定。肉桂酸、肉桂醛的RSD分別為0.34%，0.78%，提示該方法的重復(fù)性良好。

2.4.9 飲片均一性評價

以肉桂酸及肉桂醛為考察指標(biāo)，測定其在原飲片及煮散飲片中的含量，結(jié)果顯示，混合制成煮散飲片后指標(biāo)成分煎出率有所提高；且其含量均值的RSD值也明顯減小，表明飲片質(zhì)量及飲片均一性均有所提高。見表2。

2.5 飲片指紋圖譜

按照2.4.1項下方法，對肉桂飲片水提液進行指紋圖譜的測定，比較原飲片及煮散飲片指紋圖譜，結(jié)果見圖4。以肉桂原飲片（S1）為參照譜，進行自動匹配并計算指紋圖譜相似度，結(jié)果見表3。原飲片相似度在0.881～1.000之間，精準(zhǔn)煮散飲片相似度較高，均達到0.996以上，精準(zhǔn)煮散飲片的均一性明顯提高。本次研究中以原飲片中肉桂醛（Rt=26.331 min）的平均峰面積為參考峰，計算制得精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片各共有峰的相對峰面積。見表4。結(jié)果表明，煮散飲片與原飲片比較，10個共有峰相對峰面積均有所升高，均一性明顯提高。

3 討論

中藥煮散是中藥傳統(tǒng)用藥形式，源于先秦至唐宋時期盛行，是將中藥材粉碎成粗顆?；虼址垡运逯?，去渣取汁或連同藥渣服用。其缺點在于粉碎過程中破壞藥材形態(tài)，喪失藥物鑒別特征，導(dǎo)致“辨藥之難”，宋元時期后逐步被中藥飲片所取代[8-9]。近年來，中藥DNA條形碼鑒定技術(shù)備受關(guān)注，該技術(shù)不受藥材形態(tài)、外界環(huán)境因素和個人經(jīng)驗的影響，鑒定結(jié)果重復(fù)性良好，方法通用性較強[10-12]，非常適合于破碎藥材、近緣種、易混淆品種的鑒定[13]。結(jié)合現(xiàn)代中藥指紋圖譜技術(shù)，構(gòu)建精準(zhǔn)化的中藥質(zhì)量控制體系，提供精準(zhǔn)化的中藥識別溯源與檢測，實現(xiàn)藥品基原、生產(chǎn)加工及市場流通等多領(lǐng)域監(jiān)管提供了可能性[14]。

我們以常用中藥肉桂為例對精準(zhǔn)煮散飲片用藥形式進行了探索。精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片相比，僅改變中藥飲片的性狀規(guī)格，使其微小化、均一化，但其內(nèi)涵超越了原飲片及傳統(tǒng)中藥煮散，可實現(xiàn)飲片質(zhì)量均一化，分裝、調(diào)劑、煎煮自動化，使中藥劑量和湯劑質(zhì)量更加準(zhǔn)確穩(wěn)定。本實驗結(jié)果表明，肉桂的煮散飲片與原飲片具有屬性的一致性，煎出成分基本沒有變化，但指標(biāo)性成分肉桂醛、肉桂酸及大多數(shù)共有峰的提取率有不同程度升高，且均一性明顯提高。

我們采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煮法進行實驗，符合臨床用藥方式，為中藥飲片的應(yīng)用提供了很好的參考價值。肉桂的指標(biāo)性成分肉桂酸、肉桂醛具有揮發(fā)性，精準(zhǔn)煮散飲片因其顆粒較小，化學(xué)成分易溶出，煎煮同樣時間，精準(zhǔn)煮散飲片成分隨水蒸氣揮發(fā)更多，導(dǎo)致實驗結(jié)果提升不明顯，因此對于肉桂精準(zhǔn)煮散飲片的煎煮時間，有必要進一步研究。在中藥市場混亂及中藥資源匱乏的今天，我們急需建立一種有效保證中藥質(zhì)量的市場體系，精準(zhǔn)飲片的提出是適應(yīng)時代的發(fā)展。本研究基于“精準(zhǔn)煮散飲片”理論，以節(jié)約中藥資源，全面控制飲片質(zhì)量，保證臨床療效為核心理念，我們可利用二維碼技術(shù)對中藥飲片進行質(zhì)量追蹤，包括有效成分，產(chǎn)地來源，加工方法等所有信息含量，方便醫(yī)生開藥，為以后臨床大數(shù)據(jù)的挖掘奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：136-137.

[2]韓亞明，蔣林，黃正恩，等.廣西、云南產(chǎn)肉桂油化學(xué)成分及分子蒸餾技術(shù)純化研究[J].中南藥學(xué)，2005，3（4）：215-218.

[3]黃亞非，黃際薇，陶玲，等.不同樹齡肉桂揮發(fā)油的成分比較[J].中山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，44（1）：82-85.

[4]Kanari M，Tomoda M，Gonda R，et al.A reticuloendothelial system-activating arabinoxylan from the bark of Cinnamomum cassia[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），1989，37（12）：3191-3194.

[5]邱琴，崔兆杰，韋棟梁，等.肉桂揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，17（3）：49-51.

[6]康廷國.中藥鑒定學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：255.

[7]徐洋洋，王添敏，初正云，等.HPLC-DAD測定5種商品規(guī)格肉桂及兩種偽品中桂皮醛的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（1）：90-93.

[8]李睿，翟華強，田偉蘭，等.中藥煮散的歷史源流及其與現(xiàn)代配方顆粒的對比性分析[J].中國中藥雜志，2016，41（5）：965-969.

[9]穆蘭澄，曹京梅，李冀湘，等.中藥煮散的歷史沿革與現(xiàn)代研究概述[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（7）：74-75.

[10]Wu L，Sun W，Wang B，et al.An integrated system for identifying the hidden assassins in traditional medicines containing aristolochic acids[J].Sci Rep，2015，5：11318.

[11]Wang M，Zhao H X，Wang L，et al.Potential use of DNA barcoding for the identification of Salvia，based on cpDNA and nrDNA sequences[J].Gene，2013，528（2）：206-215.

[12]Yuan QJ，Zhang B，Jiang D，et al.Identification of species and materia medica within Angelica L.（Umbelliferae）based on phylogeny inferred from DNA barcodes[J].Mol Ecol Resour，2015，15（2）：358-371.

[13]Chen S，Pang X，Song J，et al.A renaissance in herbal medicine identification：from morphology to DNA[J].Biotechnol Adv，2014，32（7）：1237-1244.

[14]陳士林，劉安，李琦，等.中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略[J].中國中藥雜志，2016，41（8）：1367-1375.