王亮亮 邱宇 陳同強 唐小蘭

摘要：西地那非等均屬于5磷酸二酯酶（PDE5）抑制劑的處方藥，于1998年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，是治療男子陰莖勃起功能障礙（ED）的有效藥物，但長期或超劑量服用易對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴重損傷。隨著人們健康意識的增強，各種含有人參、枸杞、紅棗、蛹蟲等中藥或動植物的保健酒越來越多，而不法商家為了謀取暴利，在保健酒中隨意添加西地那非，給消費者的健康埋下極大隱患，也造成行業(yè)中亂象叢生。2015年7月31日，國家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布通告，近51家企業(yè)，在69種保健酒、配制酒中非法添加了西地那非等化學物。因此，我們有必要建立對于西地那非等非法添加藥物的檢測。

關鍵詞：高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜;西地那非;非法添加;比較與改進

對于PDE5及其衍生物的檢測方法，國內(nèi)基本采用的是高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，其僅通過保留時間和光譜圖定性，會經(jīng)常受雜峰干擾，出現(xiàn)假陽性的情況。而高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）具有高靈敏度和高選擇性，可成為非法添加化學成分定性確證的有效工具。目前，關于西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、那紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、他達那非、氨基他達那非、紅地那非11種物質(zhì)的方法檢測尚未形成國家標準，現(xiàn)國內(nèi)關于那非等非法添加物的檢測還只局限于一種或幾種。

本文通過高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定11種非法添加藥物殘留量的定性、定量分析方法。通過對樣品前處理、色譜柱、流動相等條件進行比較，采用乙腈水提取，HypersilGold-C18分離柱（150mm×4.6mm，3μm）分離，乙腈和水（0.1%甲酸+5 mM乙酸銨）為流動相，以電噴霧離子源正離子多反應監(jiān)測（MRM）模式進行MS/MS檢測。該方法11種混合藥物在1.0ng/mL-40ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)均達到0.999以上，添加3個水平的平均回收率為91.4%-118.9%，相對標準偏差（RSD，n=6）為2.5%-7.9%，并檢測了配制酒、保健品、功能性飲料等50批次樣品中的11種非法添加物，效果良好。

一、材料與方法

1.主要儀器與試劑。

1.1儀器。液相色譜一三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：AB/SCIEXQTRAP 4500，美國AB/SCIEX公司，配有電噴霧電離源（ESI）;振蕩器：TTL-800型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;臺式高速離心機：TG16-WS型，長沙市平凡儀器有限公司;漩渦混合儀：VORTEX型，美國Scientific Industries公司;超聲波清洗器：BK-900C，濟寧豐鑫超聲設備有限公司;電子天平：BSA224s型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2試劑。標準品西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、那紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、他達那非、氨基他達那非、紅地那非，均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇：色譜純，上海安譜有限公司;甲酸：AR，上海國藥有限公司;試驗用水為超純水。

1.3試驗材料。試驗所用樣品均采自湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院日常抽檢。

2.方法。

1.1不同樣品前處理比較。方法A：準確稱取2g試樣（精確至0.01g）于50mL容量瓶中，加入40mL乙腈，超聲3 0min，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，上機測定。方法B：準確稱取樣品2.0g（精確至0.01g）于50.0mL比色管中，用純水溶解，渦旋混勻后超聲3 0min，冷卻至室溫后定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，上機測定。方法C：準確稱取樣品2.0g（精確至0.01g）于50.0mL比色管中分別加入25.0mL20%、40%、60%、80%的乙腈水溶液，渦旋混勻后超聲30min，冷卻至室溫后定容至刻度，供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。其提取試劑及濃度、稀釋定容液的選擇經(jīng)試驗優(yōu)化得出。

1.2標準溶液的配制?；旌蠘藴蕛湟旱呐渲疲壕_稱取西地那非等11種標準品10.0 mg，用乙腈定容至10.0mL，得到混合標準儲備液，濃度為1.0mg/mL，于-20℃冰箱保存?；旌蠘藴使ぷ饕旱呐渲疲簻蚀_移取一定量的混合標準儲備液，用乙腈配制成100ng/mL的標準中間液，用20%的乙腈水溶液稀釋，配制成一系列的混合標準工作液，其濃度梯度為：0.00ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0n/mL、40.0ng/mL。

1.3不同色譜條件比較。不同色譜柱選擇比較：選擇Hypersil Gold-C18 （150mm×4.6mm，3μm）、BEH C18（100×2.1mm， 1.7μm）及SB-C18 （3.0 mm×50 mm，1.8μm）三種色譜柱進行比較。不同流動相條件比較：選擇水相（含0.l%甲酸+5mM乙酸銨）和乙腈、水相（含0.1%甲酸）和乙腈、水相（含5mM乙酸銨）和乙腈三種不同流動相進行比較，通過優(yōu)化得到最佳梯度洗脫程序，洗脫程序見表1。其他參考條件保持一致，柱溫：35℃;流速：0.200 mL/min;進樣量：5μL。

1.4質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子化源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：MRM多反應監(jiān)測，霧化器壓力：25Psi;輔助加熱氣：5L/min;干燥氣溫度：330℃;離子噴霧電壓2500V;毛細管溫度：350℃，另定性離子對、定量離子對、碎裂電壓及碰撞能量等參數(shù)經(jīng)試驗優(yōu)化得出。

二、結果與分析

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

根據(jù)11種目標化合物的化學結構及分子量，分別進行了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，先通過全掃描方式找到母離子，MS2模式全掃描得到二級質(zhì)譜掃描圖，找到2-3個子離子，再逐個對子離子進行碎裂電壓及碰撞電壓的優(yōu)化。定性離子對、定量離子對、碎裂電壓及碰撞能量參數(shù)如表2。

2.不同樣品前處理方法比較。

（1）三種方法的結果比較。分別用三種方法對西地那非陽性樣品配制酒、伽瑪片糖果、膠囊進行測定，其中方法C的提取液用80%的乙腈水溶液。結果如表3所示。由表可知，對于配制酒，三種方法的結果相差不大，而伽瑪片糖果、膠囊（保健品）的結果有明顯不同，這可能是因為產(chǎn)品基質(zhì)不同，有部分物質(zhì)不溶于水或不溶于乙腈，導致目標物無法與提取試劑接觸，提取效率不高，故方法C最優(yōu)。

（2）方法C提取溶劑的優(yōu)化：經(jīng)不同比例的乙腈提取比較，以目標化合物的響應面積和強度作為評價指標，得出在20%、40%、60%、80%的濃度里，80%乙腈水溶液作為提取溶劑時，那非物質(zhì)的響應面積和強度較高、平均回收率高，故用80%的乙腈作為方法C的提取溶劑。

（3）樣品稀釋液的選擇優(yōu)化：由于質(zhì)譜的靈敏度高，對于非法添加的化合物，高濃度的含量容易污染檢測器或留有殘留影響下一針的結果，應進一步稀釋提取液再進行檢測。試驗發(fā)現(xiàn)，因為色譜檢測中的溶劑效應影響，經(jīng)一定濃度的乙腈水溶液配制的標準工作液的離子色譜圖峰形相對純乙腈較好。綜合考慮流動相中乙腈的初始比例（約20%）及目標化合物的溶解性，采用20%的乙腈水溶液作稀釋定溶液。

3.不同色譜柱的選擇及比較。

為使目標化合物的峰形及分離效果達到最佳，本實驗選用三種色譜柱進行比較，結果發(fā)現(xiàn)Gold-C18（ 150mm×4.6mm，3μm）的峰形及靈敏度最好，另兩種色譜柱的承受壓力能力和出峰情況不及Gold-C18 （150mm×4.6mm，3μm），采用BEH C18（ 100mm×2.1mm.1.7μm）時，有兩種物質(zhì)的出峰時間太早，易受基質(zhì)或雜峰干擾;而SB-C18 （3.0mm×50mm，1.8μm）的耐壓強度及使用壽命相對差，故選用HypersilGold-C18（150mm×4.6mm，3μm）繼續(xù)進行試驗。

4.不同流動相條件的比較。

流動相的選擇對目標物的離子化及質(zhì)譜檢測的靈敏度有一定作用。本實驗按照1.3中不同流動相條件進行不同的流動相經(jīng)梯度洗脫程序（表1）對11種那非物質(zhì)進行分離，水相分別為0.1%甲酸+5mM乙酸銨溶液0.1%甲酸溶液、5mM乙酸銨溶液，有機相為純乙腈。結果表明，采用0.1%甲酸+5mM乙酸銨溶液一乙腈作為流動相，目標化合物的峰形尖銳、對稱，優(yōu)化后的11種那非物質(zhì)的總離子流圖見圖1。

5.線性范圍和檢出限。

根據(jù)選定的色譜及質(zhì)譜條件，采用方法C測定11種目標化合物的6水平混合標準工作液，分別以目標化合物的濃度（ng/mL）為X軸，對應峰面積為Y軸，繪制標準曲線，如表3所示，在1.0ng/mL-40.0ng/mL的范圍內(nèi)，線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。根據(jù)GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F.4對檢出限（LOD）為噪音比S/N=3的定義，得出11種那非物質(zhì)相應的檢出限。

6.方法的回收率和精密度。

準確稱取陰性樣品2.0g，添加低、中、高3水平的標準溶液，按方法C做加標回收實驗，如表4所示，11種目標化合物的加標回收率范圍為91.4%-118.9%，相對標準偏差（RSD，n=6）為2.5%-7.9%。說明本方法的準確度高，精密度良好。

由此可見此類藥物非法添加現(xiàn)象普遍存在，需引起監(jiān)管部門重視。

本研究結果表明，提取試劑及濃度對不同樣品中目標化合物的提取效率不同，也為廣大分析工作者提供了用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定西地那非等11種非法添加藥物殘留量的檢測方法。該方法快速、準確，為高通量檢測其他非法添加藥物提供有效的參考依據(jù)和方法思路借鑒。

從檢測結果發(fā)現(xiàn)，配制酒及壯陽類保健品中違法添加的那非類藥物以西地那非居多，應引起重視。另PDE-5抑制劑及其衍生物種類居多，不少商家為避開監(jiān)管，添加新型罕見的類似藥物，使得食品安全監(jiān)管形勢日趨復雜，任務更為艱巨。為更有效地規(guī)范市場，使行業(yè)更加健康、有序地發(fā)展，應進一步擴大檢測范圍，提高監(jiān)管力度。