王振苗 董麗榮 賈評(píng) 田慧

摘要 目的：分析苦苣菜水提物對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行研究。方法：雄性健康SD小鼠100只，隨機(jī)分成10組，每組10只，5組進(jìn)行耳腫實(shí)驗(yàn)，5組進(jìn)行足腫實(shí)驗(yàn)。耳腫實(shí)驗(yàn)與足腫實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)置模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽(yáng)性藥物組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組。檢測(cè)不同組間血清及炎性組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。結(jié)果：不同劑量組間小鼠耳廓腫脹度存在差異，各組腫脹抑制率分別為73.12%、43.62%、28.83%、9.61%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠耳廓腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。不同劑量組間小鼠足跖腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為54.80%、35.09%、29.73%、17.46%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠足跖腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。苦苣菜水提物對(duì)小鼠炎性組織液中炎性反應(yīng)相關(guān)因子的影響：陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？嘬牟怂嵛飳?duì)小鼠血清中炎性反應(yīng)相關(guān)因子的影響：陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量的COX-2、p38 MAPK水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：苦苣菜水提物的抗炎機(jī)制涉及到炎性反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)和炎性反應(yīng)因子，有望研發(fā)成為有效的抗炎新藥，為防治炎性反應(yīng)性疾病提供新的藥用和食療資源。

關(guān)鍵詞 苦苣菜水提物；炎性反應(yīng)；通路；調(diào)節(jié)；機(jī)制

Abstract Objective：To analyze water extract of Sonchus Oleraceus on the regulation of related pathways of body′s inflammatory， and further investigate the mechanism of it. Methods：A total of 100 healthy male SD mice were randomly divided into 10 groups （n=10）. Five groups of mice were treated with ear swelling experiment， and foot swelling experiment was used in mice of another five groups. In ear swelling test and foot swelling experiments， model group and dexamethasone group （2 mg/kg） positive drug group， water extract of Sonchus 0.26 g/10 g dose group， water extract of Sonchus 0.13 g/10 g dose group and water extract of Sonchus 0.065 g/10 g group. The levels of COX-2， p38 MAPK， TNF-α and IL-6 in different serum and inflammatory tissue fluid of different groups were detected. Results：There were significant differences of ear swelling degree in different dose groups. The inhibition mice were 73.12%， 43.62%， 28.83%， respectively. Compared with the model group， mice auricle swelling with water extract of Sonchus oleraceus of different dose was inhibited， and with the increase of the dose， inhibition effect was enhanced. There were significant differences in the swelling degree of paw in different dose groups， and the inhibition rates were 54.80%， 35.09%， 29.73% respectively in each group. Compared with the model group， mice paw swelling with Sonchus oleraceus water extract of different dosage were inhibited， and with the increase of the dose， inhibition effect was enhanced. Effects of water extracted of Sonchus oleraceus related factors on the inflammatory tissue of mice in the solution： positive control group， Sonchus oleraceus water extracted dose and high dose group with COX-2， p38 MAPK， TNF-α， IL-6 levels compared with the model group， and there was significant difference （P<0.05）. Effects of water extract of Sonchus oleraceus of inflammation related factors in sera of mice： positive control group， Sonchus oleraceus water extract in dose of COX-2 and p38 MAPK levels compared with the model group， and there was significant difference （P<0.05）； The positive control group， water extract of Sonchus oleraceus middle dose group and high dose group of TNF-α and IL-6 levels compared with the model group， there was significant difference （P<0.05）. Conclusion：Anti-inflammatory mechanism of water extract of Sonchus oleraceus involves many aspects and inflammatory factors in the process of inflammation， which is expected to be developed into new anti-inflammatory drugs effectively， providing new medicinal and therapeutic resources for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

Key Words Water extract of Sonchus oleraceus； Inflammation； Pathway； Regulation； Mechanism

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.048

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.），又名：苦菜、滇苦菜、苦荬菜等，屬菊科，苦苣菜屬?？嘬牟藢僦参锏闹饕钚猿煞质潜栋胼祁惡忘S酮類，此外，還有香豆素類、甘油酸酯苷類、木脂素類等?？嘬牟思疤崛∥锞哂薪笛?、降壓、降脂、利尿、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦苣菜屬植物可明顯抑制動(dòng)物耳腫、足腫，抑制毛細(xì)血管的通透性，從而發(fā)揮抗菌、抗炎作用[2]。在臨床常與其他中藥配伍用于治療胃腸炎、肺炎、咽喉炎等多種疾病?？寡讬C(jī)制涉及到抗氧化、抑制NO生成和細(xì)胞凋亡等多方面內(nèi)容，機(jī)制復(fù)雜，因此目前尚缺乏系統(tǒng)的闡明[3]。本課題通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠后足跖腫脹建立動(dòng)物模型，以探討苦苣菜水提物的抗炎作用；通過(guò)檢測(cè)小鼠炎性組織液和血清中環(huán)氧化酶（Epoxidase-2，COX-2）、p38絲裂原活化蛋白酶（p38 Mitogen-activated Protein Kinases，p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎性反應(yīng)相關(guān)因子的水平變化，進(jìn)一步分析苦苣菜水提物通過(guò)炎性遞質(zhì)對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，為防治炎性反應(yīng)性疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性健康SD小鼠100只，體質(zhì)量20～22 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于室溫（23.0±2.0）℃、濕度40%動(dòng)物室內(nèi)，自由攝食，飲水，1周后用于實(shí)驗(yàn)，至實(shí)驗(yàn)時(shí)體質(zhì)量為30～35 g。

1.1.2 藥物 苦苣菜水提物的制備：稱取苦苣菜全草原生藥130 g，水中浸泡30 min，按照1∶10比加水煎煮60 min，收集濾液A，濾渣再次按1∶10加水煎煮45 min，得濾液B，合并兩次所得濾液，濃縮得1.3 g/mL濃縮液，冷卻，4 ℃保存待用。

1.1.3 試劑與儀器 Sigma4-15高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），Tecan Safire2酶標(biāo)儀（意大利Tecan公司），LE225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）等。二甲苯分析純（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110707），角叉菜膠（德國(guó)Sigma公司，批號(hào)127H1227），COX-2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試劑盒、p38 MAPK（ELISA）試劑盒、TNF-α（ELISA）試劑盒、IL-6（ELISA）試劑盒（均購(gòu)自北京冬歌生物科技有限公司，批號(hào)201501）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠隨機(jī)分成10組，每組10只，其中耳腫實(shí)驗(yàn)和足腫實(shí)驗(yàn)各5組。二甲苯致耳腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)各涂抹二甲苯0.02 mL，30 min后處死小鼠，剪下左右耳，使用打孔器在雙耳同一部位打下等大的圓形耳片，稱重左、右耳片，以重量之差作為腫脹度。角叉菜膠致足跖腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL，5 h后處死小鼠，于跟骨水平對(duì)稱剪下鼠足，稱重左、右足，以重量差作為鼠足腫脹度。腫脹抑制率（%）=（模型組-給藥組）/模型組×100。

1.2.2 給藥方法 參照“常用動(dòng)物與人體表面積比值表”，確定本次實(shí)驗(yàn)各組苦苣菜水提物給藥濃度分別為0.26 g/10 g、0.13 g/10 g、0.065 g/10 g。稀釋1.3 g/mL濃縮液得各組所用溶液。耳腫實(shí)驗(yàn)中分為耳腫模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g、0.13 g/10 g及0.065 g/10 g劑量組。足腫實(shí)驗(yàn)中分為足腫模型組、地塞米松（2 mg/10 g）陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g、0.13 g/10 g及0.065 g/10 g劑量組。各組均采用灌胃（ig）給藥，苦苣菜水提物各劑量組給藥劑量按體質(zhì)量計(jì)算（0.2 mL/10 g），陽(yáng)性對(duì)照組按2 mg/10 g給予地塞米松磷酸鈉溶液，模型組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥5 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 炎性反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)的含量測(cè)定。血清：室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min（3 000 r/min）。收集上清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，可再次離心。炎性組織液：整個(gè)致炎小鼠足爪稱重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理鹽水中，充分浸泡。離心20 min（3 000 r/min，-4 ℃），制得炎性組織液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)ELISA試劑盒說(shuō)明，應(yīng)用雙抗體夾心法，檢測(cè)血清及炎性組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)а=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦苣菜水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫的影響不同劑量組間小鼠耳廓腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為73.12%、43.62%、28.83%、9.61%。相較于模型組，苦苣菜水提物各組小鼠的耳廓腫脹均受到程度不等的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。見表1。

2.2 苦苣菜水提物對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫的影響 不同劑量組間小鼠足跖腫脹度存在差異；各組腫脹抑制率分別為54.80%、35.09%、29.73%、17.46%。與模型組比較，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠足跖腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。見表2。

2.3 苦苣菜水提物對(duì)小鼠炎性組織液中炎性反應(yīng)相關(guān)因子的影響 陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 苦苣菜水提物對(duì)小鼠血清中炎性反應(yīng)相關(guān)因子的影響 陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量的COX-2、p38 MAPK水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的TNF-α、IL-6水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

炎性反應(yīng)是指機(jī)體在致炎因子作用下所發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的病理過(guò)程。既有紅、腫、熱、痛、功能障礙等局部反應(yīng)，也有發(fā)熱、白細(xì)胞種類和數(shù)量的變化等全身反應(yīng)[4]。炎性遞質(zhì)是指在炎性反應(yīng)過(guò)程中在細(xì)胞或體液中產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，其通過(guò)各種途徑作用于血管，造成血管擴(kuò)張、通透性增加，在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。本研究通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠后足跖腫脹建立急性炎性反應(yīng)模型，以研究苦苣菜水提物對(duì)炎性反應(yīng)的拮抗作用。本研究結(jié)果顯示，苦苣菜水提物可明顯改善二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹與角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹，且在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，抑制效果與所用劑量呈正相關(guān)。提示苦苣菜水提物具有明顯的抗炎作用，與之前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6]。

炎性反應(yīng)的發(fā)生涉及到多方面的因素，炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生與作用過(guò)程亦非常之復(fù)雜[7]。單靶點(diǎn)抗炎藥物往往無(wú)法獲得滿意療效，因此多靶點(diǎn)藥物的研發(fā)成為抗炎領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。在我國(guó)歷史上很早就有苦苣菜被當(dāng)做藥物使用的記載，在藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中都詳細(xì)記載了苦苣菜的藥理作用，由于藥性偏寒，味道較苦，被認(rèn)為具有清熱解毒、涼血止血等功效，在腸炎、痢疾、吐血等病癥的治療方面取得顯著效果[9]?？嘬牟撕卸喾N活性成分，除槲皮素、槲皮黃甙、吡喃葡萄糖甙等黃酮類成分外，還含有多種人體必需的微量元素，被認(rèn)為是具有多靶點(diǎn)抗炎作用的傳統(tǒng)中藥[10]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道較多的炎性反應(yīng)通路主要包括細(xì)胞因子及其受體、一氧化氮途徑、花生四烯酸代謝途徑、MAPK信號(hào)及NFJB信號(hào)途徑等[11]。本研究主要選取COX-2-MAPK通路志TNF-α-IL-6通路對(duì)苦苣菜水提物的抗炎作用進(jìn)行深入探討。

COX-2又稱前列腺素過(guò)氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速酶，可以將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等多種炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。在多種炎性反應(yīng)性疾病的滲出液中均可檢測(cè)到COX-2mRNA和COX-2蛋白的高表達(dá)[13]。因此，近年來(lái)COX-2被作為新型非甾體抗炎藥的作用靶點(diǎn)，從天然藥物中篩選有效的COX-2抑制劑成為研發(fā)新型抗炎藥物的有效途徑。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs）在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在[14]。目前已發(fā)現(xiàn)存在多條并行的MAPKs信號(hào)通路，哺乳類細(xì)胞主要存在以下3條并行的MAPKs信號(hào)通路：ERK（Extracellular Signal-regulated Kinase）信號(hào)通路，JNK（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）/SAPK（Stress-activated Protein Kinase，SAPK）通路與p38 MAPK通路。其中p38 MAPK通路在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與了炎性反應(yīng)遞質(zhì)的合成調(diào)控，被認(rèn)為是抗炎藥物的重要靶點(diǎn)。TNF-α是一種由內(nèi)毒素激活的淋巴細(xì)胞所分泌的具有多活性的細(xì)胞因子，具有雙重生物學(xué)作用，一方面是機(jī)體免疫防護(hù)的重要遞質(zhì)，另一方面也可參與機(jī)體的免疫病理?yè)p傷。TNF-α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤和炎性反應(yīng)作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，同時(shí)還能刺激其他細(xì)胞因子如IL-4和IL-6的釋放，擴(kuò)大后者的生物效應(yīng)，作為一種重要炎性反應(yīng)遞質(zhì)為人們所重視。IL-6被稱為細(xì)胞因子的核心成員，是機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。已證明在多種自身免疫及腫瘤性疾病中均有異常，并與這些疾病的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。IL-6可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的分化，刺激肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白，后者可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化與聚集，催化和放大炎性反應(yīng)，對(duì)組織細(xì)胞帶來(lái)?yè)p害，因此被當(dāng)做反映機(jī)體炎性反應(yīng)和組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。IL-6不能刺激相應(yīng)細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其他細(xì)胞因子的效果。許多研究表明，IL-6是某些自身免疫性疾病中的關(guān)鍵炎性因子，疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，苦苣菜水提物可不同程度抑制COX-2、p38 MAPK的生成，對(duì)炎性反應(yīng)遞質(zhì)的合成起到有效的調(diào)控作用，進(jìn)而緩解炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，苦苣菜水提物的抗炎機(jī)制涉及到炎性反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)和炎性反應(yīng)因子，具有多靶點(diǎn)作用抗炎藥物的特點(diǎn)，符合目前抗炎有效藥物的研究方向，有望研發(fā)成為有效的抗炎新藥，為防治炎性反應(yīng)性疾病提供新的藥用和食療資源。

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