郭健　路宏博　趙小旭等

[摘要]本研究建立在快速定量檢測(cè)大米中，重金屬離子鎘的膠體金免疫層析試紙條分析方法，通過一系列的實(shí)驗(yàn)研究了該方法的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和精密度較高，并且重金屬離子鎘快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析，該系統(tǒng)小巧輕便、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果可以追溯，適用于糧庫(kù)篩查和監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞]鎘；膠體金免疫層析法；大米

中圖分類號(hào)：TS207.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180209

鎘是一種蓄積性毒物，以二價(jià)離子形式存在于環(huán)境中，易導(dǎo)致人體高血壓、骨折、癌癥和腎功能紊亂等疾病，是對(duì)人類健康有巨大毒害作用的金屬元素之一，在食品中應(yīng)及時(shí)檢出。水稻是對(duì)鎘吸收最強(qiáng)的谷類作物，其超標(biāo)率達(dá)10.3%，并且我國(guó)一半以上的人口以大米作為主食，確保其安全性至關(guān)重要。

目前，鎘的檢測(cè)方法主要為儀器法，包括電化學(xué)分析法、原子吸收法、電感耦合、離子體原子發(fā)射光譜法、離子體質(zhì)譜法、溶出伏安法等各種方法的聯(lián)用，儀器法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確但是設(shè)備昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要專門的技術(shù)人員進(jìn)行操作，且不能用于現(xiàn)場(chǎng)和大規(guī)模的檢測(cè)，因此急需建立一種快速、穩(wěn)定的檢測(cè)大米中重金屬離子鎘的方法。

本文基于已經(jīng)開發(fā)出的膠體金快速檢測(cè)試紙條，對(duì)建立的定量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期用于現(xiàn)場(chǎng)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

1材料與方法

1.1主要儀器

干式加熱器、膠體金讀數(shù)儀、200μL移液器、計(jì)時(shí)器、離心管（50mL，20mL）、槍頭、一次性手套、離心機(jī)、原子吸收光譜儀、渦旋混合器、分析天平，20目篩網(wǎng)。

1.2主要試劑

超純水、硝酸、硫酸、EDTA、乙酸乙酯、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉等。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)原理

重金屬鎘檢測(cè)試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制膠體金免疫層析的原理，結(jié)構(gòu)如圖1所示。將金標(biāo)抗體結(jié)合在金標(biāo)墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于NC膜上，當(dāng)待測(cè)樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，通過層析作用向前移動(dòng)。當(dāng)移至（T線）區(qū)域時(shí)，偶聯(lián)抗原和未結(jié)合金標(biāo)抗體結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)線（T線）上，剩余金標(biāo)抗體越過檢測(cè)線（T線），在質(zhì)控線（c線）處與二抗結(jié)合顯色，配合儀器讀取結(jié)果。

1.3.2檢測(cè)方法

1.3.2.1樣品前處理

稱取2.0g±0.02g均質(zhì)（過20目篩網(wǎng)）樣本于50mL離心管中，加入6mL硝酸溶液（0.5M）和4mL乙酸乙酯，具塞，充分振蕩5min后，4000rpm離心5min；取1mL上清，加入2mL硫酸溶液（1M），振蕩3min，4000rpm離心3min；棄上清，取500μL下清，立即加入0.5M PBS溶液（5min內(nèi)），振蕩混勻；取250μL該混合液，加入200μLLEDTA-水溶液（0.5M），振蕩均勻，1min內(nèi)待檢。

1.3.2.2檢測(cè)步驟

（1）在進(jìn)行檢測(cè)前先完整閱讀使用說明書，從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)量的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記；微孔試劑取出后，立即蓋好試劑桶蓋。

（2）使用前將試紙條、微孔試劑和待檢樣品恢復(fù)至室溫25℃；將所需微孔試劑置于加熱器上的微孔中。一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要超過4個(gè)；如果一次檢測(cè)樣品數(shù)量超過4個(gè)，請(qǐng)按照4個(gè)一組，分批檢測(cè)。

（3）用微量移液器移取200μL回溫后的樣品于微孔試中，緩慢抽吸至檢測(cè)樣品與微孔試劑充分混勻；使用計(jì)時(shí)器，開始計(jì)時(shí)。

（4）40℃條件下孵育5min；孵育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)；從試劑桶中取出所需數(shù)量的試紙條并插入微孔試劑中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中；再次按下計(jì)時(shí)器，開始第二次5min孵育。

（5）第二次5min孵育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)；取出試紙條，擦除下端樣品墊，立即使用讀數(shù)儀讀取檢測(cè)結(jié)果。注意不要接觸或損壞測(cè)試條中部檢測(cè)區(qū)域，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果。

（6）檢驗(yàn)完畢，剩余試紙條和微孔試劑放回試劑桶并蓋緊桶蓋，剩余所有的試劑蓋緊瓶蓋，一起放回試劑盒中，2～8℃保存。

1.3.2.3評(píng)價(jià)方法

配置高、中、低三種濃度的糙米樣品，其中低濃度樣品為88.1μg/kg，中濃度樣品為169μg/kg，高濃度樣品為261μg/kg。每組7份評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)樣品，由3位實(shí)驗(yàn)員所用樣品提供的方法分別獨(dú)立提取每組樣品，并按照所用樣品提供的方法檢測(cè)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和檢測(cè)均值。

按照上述檢測(cè)步驟進(jìn)行操作，分別測(cè)定該方法的準(zhǔn)確度、精密度。其中準(zhǔn)確度依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定值的檢測(cè)偏差判定，用回收率表示，回收率計(jì)算方式如下：

回收率=樣品檢測(cè)均值/樣本標(biāo)定值×100%

精密度的測(cè)定：精密度依據(jù)批內(nèi)精密度，指同一批次產(chǎn)品檢測(cè)同一樣本結(jié)果的重現(xiàn)性，用變異系數(shù)（CV）表示，變異系數(shù)（CV）計(jì)算方法如下：

變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差/樣本標(biāo)定值×100%

2結(jié)果與分析

2.3結(jié)果判定

（1）打開樣品卡殼，將定量試紙條插入樣品卡殼槽內(nèi)，保證白色NC膜表面的兩條色帶在卡殼視窗中間。

（2）將樣品卡殼插入讀數(shù)儀樣品卡槽中，按照儀器操作程序，點(diǎn)擊觸屏“檢測(cè)”鍵或“TEST”按鈕，讀取結(jié)果。

2.2評(píng)價(jià)結(jié)果

按照1.3.2進(jìn)行樣品檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

2.3準(zhǔn)確度和精密度

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度，具體結(jié)果如表2所示。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果得出，在高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，平均回收率均在±20%之內(nèi)，平均批內(nèi)精密度CV<10%。

2.4注意事項(xiàng)

（1）檢測(cè)試紙條請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用，使用前將試紙條和待檢樣本恢復(fù)至室溫。

（2）樣本大米和糙米可共用一條曲線，即糙米樣本也可用大米的曲線進(jìn)行檢測(cè)。

（3）所有溶液使用前需搖勻，試劑C會(huì)有沉淀出現(xiàn)，但不影響結(jié)果。

（4）試劑A具有微弱的揮發(fā)性，建議配帶口罩或在通風(fēng)廚中操作。

（5）樣本在振蕩完，移取1.8mL上清時(shí)，偶爾會(huì)有顆粒物堵塞槍頭的情況發(fā)生，可吹出、重新吸取。

（6）偶有樣本因顆粒度過細(xì)等出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，造成上清取液量不足，則“方法二”中第一步振蕩5min后，可以靜置10min后再離心，也可適當(dāng)增加離心時(shí)間至8～10min。

（7）檢測(cè)過程中請(qǐng)勿觸摸試紙條中央的白色膜面，如不小心接觸后請(qǐng)遺棄。

（8）槍頭與離心管等耗材不可混用，以免交叉污染。

（9）樣品要與微孔中試劑充分混合均勻，避免產(chǎn)生泡沫。

（10）第二次孵育后，務(wù)必立即去掉測(cè)試條下端的樣品墊，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果，因?yàn)樵嚰垪l干燥后顏色深度會(huì)產(chǎn)生一定變化，影響最后的結(jié)果。

（11）儀器讀取結(jié)果必須使用配套讀數(shù)儀和樣品卡槽。

（12）試劑從試劑桶取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋。用完一桶試劑再打開另外一桶。如果一次用不完8個(gè)微孔，可取用所需數(shù)量的微孔，將剩余微孔立即放回到裝有干燥劑的試劑桶中密封保存。請(qǐng)小心開啟微孔蓋，以保證全部試劑保留在微孔中。

（13）如發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果需要使用法定的確證方法進(jìn)行確證。

（14）試驗(yàn)遇到的任何問題，請(qǐng)與供應(yīng)商聯(lián)系。

3結(jié)論

通過一系列性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，重金屬離子鎘快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)，小巧輕便，方便攜帶，可以與其他檢測(cè)項(xiàng)目同時(shí)檢測(cè)，另外整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)可以搭建云平臺(tái)，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)上傳。重金屬離子鎘快速定量檢測(cè)試紙條從稱樣開始到測(cè)定結(jié)束耽擱樣本的檢測(cè)時(shí)間小于35min。方法簡(jiǎn)便，對(duì)人員專業(yè)技能要求相對(duì)較低，并且其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達(dá)到了食品中有毒有害物質(zhì)快速檢測(cè)的要求，非常適用于糧庫(kù)收購(gòu)環(huán)節(jié)的篩選和監(jiān)控工作。