穆曉玲

摘要 采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝納米粒。用動(dòng)態(tài)激光光散射（DLS）測(cè)得PSA和PSSSA的粒徑分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。體外細(xì)胞毒性和溶血性試驗(yàn)結(jié)果表明，PSA和PSSSA載體在高濃度PSA（500 μg/ml）和PSSSA（500 μg/ml）下均無(wú)細(xì)胞毒性，且均具有良好的生物相容性。

關(guān)鍵詞 普魯蘭；藥物載體系統(tǒng)

中圖分類(lèi)號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2018）02-019-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.02.009

普魯蘭多糖（pullulan）是1938年由R.Bauer發(fā)現(xiàn)的一種特殊的微生物多糖[1]，是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類(lèi)似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖普魯蘭多糖，具有無(wú)毒、水溶性好以及表面易于修飾等特點(diǎn)，目前正被逐漸應(yīng)用于納米藥物載體的研究中。然而對(duì)普魯蘭進(jìn)行疏水化修飾制備納米藥物載體的研究很少，且與形成的載藥納米粒的毒性、細(xì)胞攝取和體內(nèi)生物效應(yīng)相關(guān)的研究也很少[2]。

鑒此，文中采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒[3]，合成還原敏感的經(jīng)硬脂酸疏水改性的普魯蘭多糖，使其在水溶液中能夠自組裝形成納米粒子，并結(jié)合納米粒子體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)綜合評(píng)估其作為藥物載體的效果。

1 材料和方法

1.1 PSSSA和PSA自組裝水凝膠納米粒的制備

采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg PSSSA和PSA樣品溶于2 ml的DMSO中，然后轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO6000-8000），放置于1 L的超純水中透析48 h，前12 h每3 h換水1次，后36 h每隔8 h換水1次，將DMSO熔劑徹底透析干凈后，取出溶液，50 W超聲波清洗2 min，于10 ml容量瓶中定容。用0.45 μm濾膜過(guò)濾即得到PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒。

1.2 PSA和PSSSA粒徑、Zeta電位、臨界膠束濃度（CMC）的測(cè)定

PSA和PSSSA自組裝納米粒的粒徑、Zeta電位和多分散指數(shù)（PDI）根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射原理（DLS），在室溫條件下用1 mg/ml濃度的PSA和PSSSA自組裝納米水凝膠通過(guò)納米粒度與Zeta電位分析儀測(cè)得，每個(gè)樣品測(cè)3次。采用穩(wěn)態(tài)熒光探針?lè)▉?lái)測(cè)量PSA和PSSSA的CMC。

1.3 PSA/DOX和PSSSA載藥納米粒的體外細(xì)胞試驗(yàn)

1.3.1 MTT法檢測(cè)PSA和PSSSA載藥納米粒的細(xì)胞毒性 將指數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7細(xì)胞用細(xì)胞胰酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后加入一定濃度梯度的空白納米?；蜉d藥納米粒懸液于培基中，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加100 μl MTT溶液（終濃度為0.5 mg/ml）于5%CO2，37℃培養(yǎng)4 h。小心吸去培養(yǎng)液并加入DMSO（100 μl/孔）溶解藍(lán)紫色的甲瓚，震蕩2 min待結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm的OD值，參考波長(zhǎng)為630 nm，分別設(shè)計(jì)正常對(duì)照和空白對(duì)照（不加藥物為正常對(duì)照組，空白培養(yǎng)基為空白組），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。公式為：

細(xì)胞存活率（%）=（OD損傷孔-OD損傷孔空白）/（OD對(duì)照孔-OD對(duì)照孔空白）×100%。

1.3.2 細(xì)胞溶血性試驗(yàn) 取健康新西蘭大白兔新鮮血液8 ml，加入肝素抗凝，加入10 ml 0.9%生理鹽水稀釋?zhuān)? ml的不同濃度PSSSA和PSA中加入100 μl稀釋血液，于37℃中溫育12 h，750 rpm離心5 min，加入2 ml乙醇/鹽酸，再750 rpm離心5 min，測(cè)其在398 nm處的吸光值。陰性對(duì)照為0.9%生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為水。公式為：

溶血率（%）=（OD樣品-OD陰性）/（OD陽(yáng)性-OD陰性）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 PSA和PSSSA自組裝納米粒的基本性質(zhì)

從表1可以看出，透析法制備的PSA和PSSSA自組裝納米粒在超純水中的平均粒徑分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm，Zeta電位分別為-12.9±0.3 mV和-10.4±0.4mV。結(jié)合作圖（圖1）計(jì)算得出PSA在膠束濃度 98.5 μg/ml以上時(shí)成球，PssSA在膠束濃度 133.35 μg/ml以上時(shí)成球，即可形成自組裝納米粒。可見(jiàn)，PSA的粒徑和CMC小于PSSSA，但其Zata電位大于PSSSA，這可能是由于PSSSA中加入了二硫鍵，使其電位降低。

2.2 PSSSA/DOX和PSSSA/DOX載藥納米粒的體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞毒性能 利用COS-7細(xì)胞作為正常細(xì)胞組進(jìn)行空白納米粒的毒性試驗(yàn)，以便對(duì)載體的安全性能進(jìn)行評(píng)估。從圖2可以看出，PSA與PSSSA在濃度達(dá)到500 μg/μl時(shí)，COS-7細(xì)胞的存活率均在90%以上，說(shuō)明空白納米粒對(duì)COS-7細(xì)胞基本無(wú)毒，即PSA和PSSSA載體均具有良的生物相容性。同時(shí)還能看出隨著空白納米粒濃度的升高，細(xì)胞毒性逐漸加大。

2.2.2 細(xì)胞溶血性 利用新西蘭大白兔新鮮血液作為正常細(xì)胞組進(jìn)行空白納米粒的溶血性試驗(yàn)，從表2可以看出，隨著PSA空白納米粒濃度的增加，溶血率沒(méi)有出現(xiàn)特別明顯的趨勢(shì)變化；而隨著PSSSA空白納米粒濃度的增加，溶血率逐漸增加。

3 結(jié)論

（1）采用透析法制備經(jīng)硬脂酸修飾的普魯蘭多糖（Pullulan）衍生物PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒，粒徑大小分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。經(jīng)穩(wěn)態(tài)熒光探針?lè)y(cè)得PSA和PSSSA臨界膠束濃度分別為0.0 985 mg/ml和0.13 335 mg/ml。表明PSA和PSSSA衍生物在水溶液中均能夠自組裝形成水凝膠納米粒。

（2）MTT法測(cè)定的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)空白納米粒的濃度高達(dá)500 μg/μl時(shí)，COS-7細(xì)胞在48 h后存活率依然在90%以上；溶血性試驗(yàn)中，PSA和PSSSA濃度達(dá)到1 mg/ml時(shí)，溶血率依然在5%左右，表明PSA和PSSSA載體均基本無(wú)毒，生物相容性較好。

參考文獻(xiàn)

[1] 王浩，張曉軍，沈佳佳，等. 一種新型的胞外多糖——普魯蘭[J]. 中國(guó)食品添加劑，2005（6）：60-63.

[2] 崔雙. 生育酚改性普魯蘭自組裝納米膠束用于抗癌藥物的傳遞[D].大連：大連理工大學(xué)，2013.

[3] 蔣麗琴. 膽固醇基普魯蘭自組裝納米粒與肝癌細(xì)胞相互作用的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部，2013.

責(zé)任編輯：劉赟