艾悅言 趙學勇 付林 卞曉蓮 古銳 張靜波 南措 西繞娜姆
中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2018)20-2810-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.16
摘 要 目的:建立同時測定三味龍膽花片中馬錢苷酸、異金雀花素含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-3,流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測波長為240 nm,柱溫為30 ℃,進樣量為10 μL。結(jié)果:馬錢苷酸和異金雀花素進樣量線性范圍分別為0.040 08~4.008 0 μg(r=0.999 9)、0.021 96~2.196 0 μg(r=0.999 9);定量限分別為0.160 32、0.087 8 ng/mL,檢測限分別為0.080 16、0.043 92 ng/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為103.07%~104.26%(RSD=0.52%,n=6)、95.57%~99.61%(RSD=1.55%,n=6)。結(jié)論:該方法簡便、精確,可用于同時測定三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量。
關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;三味龍膽花片;馬錢苷酸;異金雀花素;含量測定
ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for the simultaneous determination of loganic acid and isoscoparin in Sanwei longdanhua tablets. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of methanol-0.2% phosphoric acid (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 240 nm, and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS: The linear range were 0.040 08-4.008 0 μg (r=0.999 9) for loganic acid and 0.021 96-2.196 0 μg (r=0.999 9) for isoscoparin. The quantitative limits were 0.160 32 and 0.087 8 ng/mL, and detection limits were 0.080 16 and 0.043 92 ng/mL. RSDs of precision, stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 103.07%-104.26%(RSD=0.52%,n=6) and 95.57%-99.61%(RSD=1.55%,n=6). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate and suitable for simultaneous determination of loganic acid and isoscoparin in Sanwei longdanhua tablets.
KEYWORDS HPLC; Sanwei longdanhua tablets; Loganic acid; Isoscoparin; Content determination
三味龍膽花片為國藥準字藏藥,處方中主要含白花龍膽、甘草等,具有清熱、潤肺的作用,可用于肺熱氣喘和咽喉炎等癥的治療。該制劑在國家食品藥品監(jiān)督管理局標準中已有含量測定項目,但僅以甘草有效成分甘草酸為測定指標,而甘草在該制劑中為調(diào)和藥性的藥物,并非君藥。該制劑處方中君藥為白花龍膽[1],此藥材在藏、蒙、阿薩克等民族藥中均被廣泛應(yīng)用[2-4],具有瀉肝膽實火、止咳利咽、舒筋止痛、健胃等功效,主治肺熱咳嗽及目赤咽痛等癥[5-7]。因此,有必要以白花龍膽有效成分為含量測定指標來建立該制劑的質(zhì)量標準。相關(guān)文獻指出,白花龍膽是多基源藥材,來源于大花龍膽(Gentiana szechenyii Kanitz)和高山龍膽(G. algida Pall.),但上述兩種植物成分存在較大差異[8-13]。經(jīng)過成分比較研究與分離鑒定表明,環(huán)烯醚萜類的馬錢苷酸(Loganic acid)和黃酮類的異金雀花素(Isoscoparin)是兩種源自白花龍膽的共有成分[14-16]。因此,筆者采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定了三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量,旨在為其質(zhì)量控制提供參考。
1 材料
1.1 儀器
LC-2010A(HT)型HPLC儀,包括四元泵、柱溫箱、紫外檢測器、LC Solution色譜工作站(日本Shimadzu公司);SB-5200型超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);BSA124S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司];FA1004型十萬分之一電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);ULUP-1-10T型超純水機(成都優(yōu)普超純水科技有限公司)。
1.2 藥品與試劑
馬錢苷酸對照品(成都普思生物科技股份有限公司,批號:PS0330-0025,純度:>98%);異金雀花素對照品(成都普思生物科技股份有限公司分離鑒定的對照品,純度:>98%);三味龍膽花片(宇妥藏藥股份有限公司,批號:170401、1710021037、1710031052、1710051035、1710061035、1710071003、1710071035,規(guī)格:0.5 g/片);甲醇(分析純,成都市科隆化學品有限公司);甲醇[色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司];磷酸(諾爾施HPLC級,成都市科隆化學品有限公司);其余試劑均為分析純,水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性
色譜柱:Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,21% A→25% A;5~15 min,25% A→28% A;15~35 min,28%A→40%A;35~45 min,40% A→46% A;45~50 min,46%A→21% A;50~55 min,21% A);檢測波長:240 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。在上述色譜條件下,馬錢苷酸、異金雀花素峰理論板數(shù)均大于5 000,分離度均大于1.5,陰性對照對測定無干擾,詳見圖1。
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取馬錢苷酸、異金雀花素對照品各適量,加75%甲醇溶解并稀釋,制成含馬錢苷酸0.400 8 mg/mL、異金雀花素0.219 6 mg/mL的混合對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液 取樣品10片,除去包衣,研細,精密稱取0.5 g,加75%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率:250 W,頻率:40 kHz)處理45 min,放冷,再次稱定質(zhì)量,用75%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液 按三味龍膽花片的處方和工藝制備不含白花龍膽的陰性樣品,再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。
2.3 線性關(guān)系考察
精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,加75%甲醇制成馬錢苷酸質(zhì)量濃度分別為0.400 8、0.080 16、0.040 08、0.016 032、0.008 016、0.004 008 mg/mL,異金雀花素質(zhì)量濃度分別為0.219 6、0.043 92、0.021 96、0.008 784、0.004 392、0.002 196 mg/mL的線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述線性關(guān)系工作溶液各適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以進樣量(x,μg)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸,得馬錢苷酸回歸方程為y=1 570 514.938 7x+23 270.548 7(r=0.999 9),異金雀花素回歸方程為y=2 164 949.062 0x+4 886.334 6(r=0.999 9)。結(jié)果表明,馬錢苷酸、異金雀花素進樣量線性范圍分別為0.040 08~4.008 0、0.021 96~2.196 0 μg。
2.4 定量限與檢測限考察
精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果,馬錢苷酸、異金雀花素的定量限分別為0.160 32、0.087 8 ng/mL,檢測限分別為0.080 16、0.043 92 ng/mL。
2.5 精密度試驗
取“2.3”項下線性關(guān)系工作溶液(馬錢苷酸質(zhì)量濃度為0.080 16 mg/mL、異金雀花素質(zhì)量濃度為0.043 92 mg/mL)適量,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次,記錄峰面積。結(jié)果,馬錢苷酸、異金雀花素峰面積的RSD分別為0.076%、0.832%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗
取“2.2.2”項下供試品溶液(批號:1710071035)適量,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,馬錢苷酸、異金雀花素峰面積的RSD 分別為0.590%、1.950%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.7 重復性試驗
精密稱取樣品(批號:1710071035)細粉適量,共6份,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果,馬錢苷酸、異金雀花素的平均含量分別為2.216、1.340 mg/g,RSD分別為1.314%、1.190%(n=6),表明本方法重復性良好。
2.8 加樣回收率試驗
精密稱取已知含量的樣品(批號:1710071035)細粉0.25 g,共6份,分別加入一定量的混合對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結(jié)果見表1。
2.9 樣品含量測定
分別取7批樣品細粉各適量,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,平行測定3次,記錄峰面積并按外標法計算樣品含量,結(jié)果見表2。
3 討論
試驗前期,筆者比較了50%甲醇、75%甲醇、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯5種提取溶劑對含量測定的影響。結(jié)果顯示,以50%甲醇和75%甲醇提取時,馬錢苷酸、異金雀花素兩種成分含量相近且較高,但由于以50%甲醇超聲提取后用微孔濾膜濾過時十分困難難以制樣,故選擇75%甲醇為提取溶劑。筆者又比較了25、50、75、100 mL 4種不同提取溶劑量對含量測定的影響,結(jié)果顯示,提取溶劑量為25 mL時馬錢苷酸、異金雀花素兩種成分含量均最高。另外,筆者還比較了超聲15、30、45、60 min和回流30 min 5種方式對提取效率的影響,結(jié)果顯示,超聲45 min時提取效率最高。
在色譜條件的選擇方面,最初選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進行洗脫,結(jié)果顯示,馬錢苷酸與異金雀花素峰分離度和峰形均不好;而改用甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相后,馬錢苷酸與異金雀花素峰的分離度均大于1.5且峰形均較好。另外,筆者用二極管陣列檢測器在200~400 nm波長范圍內(nèi)進行檢測,結(jié)果顯示,馬錢苷酸在240 nm波長處有最大吸收,異金雀花素雖在210、280、350 nm波長處有最大吸收,但其在240 nm波長處的峰形較好且吸收也較大,故選擇檢測波長為240 nm。
綜上所述,本方法簡便、精確,可用于同時測定三味龍膽花片中馬錢苷酸和異金雀花素的含量。
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(收稿日期:2018-04-23 修回日期:2018-08-28)
(編輯:陳 宏)