鄔賢 黃瑩 李舒婕 段萍萍 米鵬程 陳文瑛

中圖分類號 R966；R979.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2800-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.14

摘 要 目的：研究以腺病毒載體系統(tǒng)裝載人端粒酶逆轉錄酶C端片段（C197）制成的重組腺病毒Ad-GFP-C197對3種腫瘤細胞增殖的抑制作用。方法：采用HEK293細胞擴增并純化Ad-GFP-C197。采用Ad-GFP-C197分別感染人胃癌細胞SGC7901、人乳腺癌細胞MCF7和人結直腸癌細胞CaCO2。以空白腺病毒載體（Ad-GFP）為參比，采用Western blot法檢測Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細胞中C197的蛋白表達水平；采用MTT法檢測Ad-GFP-C197感染后對3種腫瘤細胞的抑制作用，繪制細胞增殖曲線并計算增殖抑制率。結果：Ad-GFP感染的3種腫瘤細胞中均未檢測到C197蛋白表達，而Ad-GFP-C197感染的上述細胞中C197蛋白均有明顯表達；Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細胞的增殖曲線隨時間延長而呈明顯抑制現(xiàn)象，其增殖抑制率最高可達37.31%～41.42%。結論：Ad-GFP-C197對SGC7901細胞、MCF7細胞、CaCO2細胞增殖均有明顯的抑制作用，且起效迅速，能夠克服其他端粒酶抑制劑起效緩慢的缺點。

關鍵詞 人端粒酶逆轉錄酶；端粒酶抑制劑；重組腺病毒；Ad-GFP-C197；腫瘤細胞；細胞增殖

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of recombinant adenovirus Ad-GFP-C197， which prepared by adenovirus vector system-loading human telomerase reverse transcriptase （hTERT） C fragment （C197）， on the proliferation of 3 kinds of tumor cells in vitro. METHODS： Ad-GFP-C197 was amplified and purified with HEK293 cells. Human gastric cancer cells SGC7901， human breast cancer cells MCF7 and human colorectal cancer cells CaCO2 were infected by Ad-GFP-C197 respectively. Using blank adenovirus carrier （Ad-GFP） as reference， the protein expression of C197 in 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP-C197 was detected by Western blot assay. The inhibitory effects of Ad-GFP-C197 on 3 kinds of tumor cells were detected by MTT assay. The cell proliferation curve was drawn and the proliferation inhibition rate was calculated. RESULTS： The protein expression of C197 was not detected in 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP， while significant protein expression of C197 was found in above cells infected by Ad-GFP-C197. The proliferation curves of the 3 kinds of tumor cells infected by Ad-GFP-C197 were significantly inhibited with the time extended， and the proliferation inhibitory rate reached 37.31%-41.42%. CONCLUSIONS： Ad-GFP-C197 shows significant inhibitory effects on the proliferation of SGC7901， MCF7 and CaCO2 cells， which is rapid to make up for the slow effect of other telomerase inhibitors.

KEYWORDS hTERT； Telomerase inhibitor； Recombinant adenovirus； Ad-GFP-C197； Tumor cell； Cell proliferation

端粒是位于染色體末端由串聯(lián)重復堿基序列（TTAGGG）和端粒結合蛋白組成的特殊結構。在正常細胞中，端粒可隨著細胞分裂而縮短，當縮短到一定程度時染色體末端會融合或降解，細胞則繼而發(fā)生衰老和死亡；但在腫瘤細胞中，端粒不會隨著細胞的分裂而縮短，因此腫瘤細胞才得以永生化[1-3]。端粒酶是一種由RNA模板和催化蛋白組成的核蛋白逆轉錄酶，能特異性地在染色體DNA末端加上堿基序列TTAGGG片段以防止端粒縮短；其在正常細胞中不表現(xiàn)活性，但在75%～95%的惡性腫瘤（如肺癌、胃癌、肝癌、大腸癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌等）組織中表現(xiàn)出明顯活性，因此被認為是惡性腫瘤最為廣泛的分子標記物[4]。

人端粒酶主要組成包括模板RNA（hTR）和人端粒酶逆轉錄酶（hTERT），其以hTR作為模板在hTERT的催化作用下延伸端粒，轉染hTERT基因到無端粒酶活性的正常組織細胞或腫瘤組織細胞中，可激活細胞中的端粒酶[5]。因此，hTERT是決定端粒酶活性的主要因素[6]，其已成為腫瘤形成、生長及發(fā)展等多種效應的核心調控分子，是抗腫瘤治療的重要靶點[7-8]。hTERT由N端（RNA結合區(qū)）、逆轉錄區(qū)（催化活性區(qū)）和C端3個功能區(qū)組成，其中C端作為延長端粒的重要功能區(qū)[9]，目前相關研究較少，故本課題組對hTERT C端進行研究。

腺病毒載體系統(tǒng)（AdEasy-1）是一種E1區(qū)和E3區(qū)雙缺失的復制缺陷型載體，主要由穿梭質粒（PAdTrack-CMV）和骨架質粒（PAdEasy-1）兩部分組成，該載體可通過在細胞內的復制大大增加治療基因的拷貝數(shù)，使治療基因呈高水平表達；而且該載體不會整合到宿主細胞內，安全性好，是應用于臨床的一種優(yōu)良的基因治療載體[10]。本課題組在前期研究中，篩選得到hTERT C端第936～1 132位共197個氨基酸片段（命名為C197），并利用綠色熒光蛋白（GFP）標記的AdEasy-1（命名為Ad-GFP）來構建裝載C197的重組腺病毒（命名為Ad-GFP-C197），結果發(fā)現(xiàn)C197能在細胞內高效表達；同時，Ad-GFP-C197在體內外對腫瘤細胞增殖和腫瘤組織生長均有抑制作用，且該抑制作用與其抑制端粒酶活性、下調hTERT蛋白水平、抑制NF-κB通路中p65蛋白和IκBα蛋白的表達有關[11]。本研究選取人胃癌細胞SGC7901、人乳腺癌細胞MCF7和人結直腸癌細胞CaCO2為對象，考察Ad-GFP-C197對上述3種腫瘤細胞增殖的抑制作用，為基于端粒酶的腫瘤基因治療提供新的思路，并為進一步實現(xiàn)C197用于腫瘤的生物治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BB15型CO2細胞培養(yǎng)箱、FC型酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；Avanti J-30I型超速離心機（美國Beckman Coulter公司）；BX43型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；1658003型電泳儀、GelDoc XR+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；TE70XP半干轉膜儀（美國Hoefer公司）；T25培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；Beckman離心管（香港弗科斯科技有限公司）；MD27透析袋（美國Viskase公司）；FFC58暗盒（廣州碧云天有限公司）；JB-CJ-1500FX型超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）。

1.2 試劑

重組腺病毒Ad-GFP-C197、不含C197的空白腺病毒Ad-GFP（本實驗室自制，液氮保存）；胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）（法國Biowest公司）；氯化銫（CsCl，上海華藍化學科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；蛋白提取試劑盒（美國Omega公司）；二甲基噻唑藍（MTT，德國Sigma公司）；鼠抗His抗體、羊抗鼠IgG抗體、內參GAPDH抗體（美國Santa Cruz公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）、顯影粉、定影粉、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（上海史瑞克生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細胞

人胚胎腎細胞系HEK293細胞、人胃癌SGC7901細胞、人乳腺癌MCF7細胞和人結直腸癌CaCO2細胞均購自上海信然生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取HEK293細胞、SGC7901細胞、MCF7細胞和CaCO2細胞，在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)液”）中，于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），待細胞生長至對數(shù)生長期時，取生長狀態(tài)良好的細胞進行試驗。

2.2 Ad-GFP-C197的擴增、純化及滴度測定

2.2.1 Ad-GFP-C197擴增 將HEK293細胞鋪于培養(yǎng)瓶中，細胞密度為1×106～3×106個/mL，分別加入培養(yǎng)液2 mL，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出。取出液氮中保存的Ad-GFP-C197，在冰浴中融化后加入培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日取出培養(yǎng)瓶，在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況（鏡下可見感染病毒的細胞呈綠色彗星狀）。培養(yǎng)3～5 d后，待1/3的細胞感染病毒時，回收細胞，在4 ℃條件下以1 000 r/min離心10 min；取下層5 mL液體重懸細胞，將重懸后的細胞反復凍融（-80～37 ℃）3次后即得病毒原液。

2.2.2 Ad-GFP-C197純化 取Beckman離心管數(shù)根，用75%乙醇浸泡30 min后，于超凈工作臺風干。在每根Beckman管中先后加入不同濃度的CsCl溶液（4、2 mol/L）2 mL，再在最上層加入“2.2.1”項下制得的病毒原液1 mL，然后在4 ℃條件下以20 000 r/min真空離心2 h。離心后小心取出，在超凈工作臺中，以5 mL注射器插入至Beckman管乳白色病毒帶處，吸出病毒帶液體。病毒帶液體采用透析袋MD27（分子量：3 500 Da）于4 ℃條件下在600 mL透析液（含10%甘油的0.01 mol/L PBS）中攪拌透析，每6 h更換一次透析液，24 h后收集透析后的純化病毒并分裝，于-80 ℃儲存?zhèn)溆肹12]。

2.2.3 病毒滴度的測定 取純化后Ad-GFP-C197和Ad-GFP，用PBS分別稀釋10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度（即分別稀釋1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107倍）。將HEK293細胞鋪于24孔板中，每孔5×105個細胞，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，分為Ad-GFP-C197組和Ad-GFP組，分別加入不同梯度的Ad-GFP-C197溶液和Ad-GFP溶液（50 μL/孔），繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。各個梯度均設置3個復孔。常規(guī)培養(yǎng)完畢后，在倒置熒光顯微鏡下計數(shù)視野中的熒光細胞，每孔計數(shù)3個視野，以每個視野20～50個熒光細胞為最佳[13]。根據(jù)熒光細胞數(shù)，按照公式計算病毒滴度：滴度（PFU/mL）=（每個視野的熒光細胞數(shù)×每個孔的視野數(shù)）/（加入的病毒液體積×稀釋梯度）。根據(jù)滴度測定結果，按實際需要的感染復數(shù)（MOI），以PBS將病毒稀釋至相應濃度，進行后續(xù)試驗。

2.3 Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細胞中C197蛋白的表達水平檢測

采用Western blot法測定C197蛋白的表達水平。試驗分為SGC7901細胞組、MCF7細胞組和CaCO2細胞組，將上述3種細胞分別鋪于培養(yǎng)瓶中，每瓶2×106個細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h；按MOI為100，分別采用Ad-GFP-C197和Ad-GFP感染上述細胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集感染后的3組腫瘤細胞，分別用蛋白提取試劑盒提取收集細胞蛋白，再經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜后，置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h；先后加入一抗（鼠抗His抗體，1 ∶ 2 000）、內參GAPDH抗體（1 ∶ 2 000）和二抗（羊抗鼠IgG抗體，1 ∶ 3 000），于4 ℃孵育1 h后，用PBS洗脫3次。在暗室中用暗盒進行壓片，經(jīng)顯影后曝光得膠片，晾干后拍照保存。采用Image J 1.48軟件分析目標蛋白條帶的灰度值以表示蛋白表達水平，重復分析3次，繪制柱狀圖。

2.4 Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細胞的增殖抑制率檢測

采用MTT法[14]測定細胞增殖抑制率。按“2.3”項下分組，將SGC7901細胞、MCF7細胞和CaCO2細胞分別鋪于96孔板中，每孔1×104個細胞，每種細胞設置6個復孔，共鋪7塊板。按MOI為100，分別采用Ad-GFP-C197和Ad-GFP感染上述細胞，常規(guī)培養(yǎng)。每隔24 h取1塊板，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內溶液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，使結晶物溶解。采用酶標儀在495 nm波長處測定吸光度（OD值），并對OD值-時間繪制細胞增殖曲線圖，其中OD值越低，則表明細胞增殖受抑制程度越高；同時，按公式計算不同時間點的細胞增殖抑制率[抑制率（%）=（ODAd-GFP-ODAd-GFP-C197）/ ODAd-GFP×100%]。

2.5 統(tǒng)計學方法

試驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計作圖軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Ad-GFP-C197擴增、純化及滴度測定結果

3.1.1 擴增結果 Ad-GFP-C197感染HEK293細胞后第2天，顯微鏡下可見彗星狀綠色熒光細胞（見圖1），表明感染成功，Ad-GFP-C197能在細胞中復制；第5天時能觀察到有三分之一的細胞被感染。

3.1.2 純化結果 經(jīng)超速離心后，可在離心管中明顯觀察到一條清晰的乳白色病毒條帶。

3.1.3 滴度測定結果 經(jīng)檢測，Ad-GFP-C197的滴度為3.14×1011 PFU/mL，Ad-GFP的滴度為2.10×1011 PFU/mL。

3.2 Ad-GFP-C197感染后腫瘤細胞內C197蛋白表達情況

Ad-GFP感染的SGC7901細胞、MCF7細胞和CaCO2細胞中均未檢測到C197蛋白的表達，而Ad-GFP- C197感染的上述3種腫瘤細胞中C197蛋白均有明顯表達。蛋白表達電泳圖見圖2，灰度值柱狀圖見圖3（注：由于Ad-GFP感染細胞的C197蛋白表達均為陰性結果，因此只提供SGC7901細胞感染后的結果）。

3.3 Ad-GFP-C197感染后腫瘤細胞的增殖抑制情況

與Ad-GFP比較，Ad-GFP-C197感染后3種腫瘤細胞的增殖曲線均表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象，SGC7901細胞、MCF7細胞均在第2天開始表現(xiàn)出受到抑制，CaCO2細胞在第3天開始表現(xiàn)出受到抑制；3種腫瘤細胞的OD值分別從第4、5、4天開始組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖4。此外，隨作用時間的延長，3種腫瘤細胞的增殖抑制率均呈升高趨勢；第3、4天時，CaCO2細胞增殖抑制率較其他2種細胞顯著更高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；第6、7天時，MCF7細胞增殖抑制率較其他2種細胞顯著更高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；3種腫瘤細胞的增殖抑制率最高可達37.31%～41.42%，詳見表1。以上結果表明，Ad-GFP-C197對3種腫瘤細胞均有顯著的增殖抑制作用。

4 討論

腫瘤細胞與正常細胞的最大區(qū)別之一是90%以上的腫瘤細胞表現(xiàn)出端粒酶活性，而端粒酶可以延長端粒，使腫瘤細胞得以永生，因此其成為區(qū)別腫瘤細胞與正常細胞的重要標志之一[15-16]。端粒酶除了能通過延長端粒促進腫瘤生長外，還能通過與Wnt信號通路的β-catenin及轉錄因子Brg1結合，發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生相關靶基因（如c-myc）表達[17-18]、調節(jié)細胞周期[19]、抑制活性氧簇（ROS）誘導的細胞凋亡[20]等作用。

人端粒酶主要由hTR、有逆轉錄活性的hTERT和端粒相關蛋白組成，hTERT是人端粒酶活性的限速酶，其表達異常增加通常被認為是腫瘤發(fā)生的前期標志[21]。hTERT含有1 132個氨基酸，主要有3個功能部分，即與hTR結合的N端、逆轉錄區(qū)、與DNA結合的C端。hTERT C端是端粒酶與染色體末端DNA 3′ 端懸突結合的功能區(qū)，是端粒酶活性的重要部分[22]。與高度保守的逆轉錄區(qū)不同，C端同源性較弱、保守性較低，是hTERT與其他逆轉錄酶的主要區(qū)別之一，也是特異性抑制端粒逆轉錄酶的重要靶位[23]。hTERT的C端含有多個結合位點和定位區(qū)，也是其在細胞內進行端粒末端復制所必需的結構域，因此筆者推測，當C197在細胞內大量表達后，因為其含有相應的結合位點，能競爭性與hTERT的底物DNA 3′端懸突結合，從而抑制細胞內hTERT活性，使細胞內的hTERT無法結合到Wnt通路啟動子上，使該通路受到抑制，進而起到抗腫瘤作用?；诖?，本課題組選擇C197進行腫瘤細胞抑制作用研究。

目前抑制端粒酶活性的抗腫瘤化合物有很多，如端粒酶抑制劑GRN163L、G-四聯(lián)體穩(wěn)定劑Telomestatin等。其中GRN163L已進入Ⅱ期臨床試驗，但進展緩慢，效果也難以令人滿意，這是因為端粒酶抑制劑作用于端粒酶后需要較長的時間才能表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這一過程一般需要20 d左右，而在體內給藥時這一過程更長[24]。在這個漫長的過程中，許多腫瘤細胞的端粒依然得以維持或代償，使得上述抗腫瘤化合物難以發(fā)揮抑制端粒酶的理想效果[25]。

本課題組前期研究對Ad-GFP-C197的表達載體進行設計時，在C197的N端加上了6個His標簽，這不但有利于檢測C197基因片段的表達，而且便于后續(xù)的蛋白純化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ad-GFP-C197感染后，C197在SGC7901細胞、MCF7細胞、CaCO2細胞中均能高水平地表達；而且上述3種細胞的增殖均受到顯著抑制，且從第2～3天起即開始表現(xiàn)出增殖抑制現(xiàn)象，起效迅速。這表明，Ad-GFP-C197克服了其他端粒酶抑制劑起效慢的缺點，能夠迅速發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。

綜上所述，Ad-GFP-C197能夠在SGC7901細胞、MCF7細胞、CaCO2細胞中高水平表達C197，且對3種腫瘤細胞均有顯著且迅速的增殖抑制作用。但C197能否對腫瘤細胞中hTERT的表達也產(chǎn)生影響尚不完全明確，其抗腫瘤作用機制還需后續(xù)進一步研究。

參考文獻

[ 1 ] SHAY JW，BACCHETTI S. A survey of telomerase activity in human cancer[J]. Eur J Cancer，1997，33（5）：787- 791.

[ 2 ] PIATYSZEK MA， KIM NW， WEINRICH SL， et al. Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol（TRAP）[J].Methods in Cell Science，1995，17（1）：1-15.

[ 3 ] 黃金，張勝平，鄧興力，等. 膠質瘤的端粒酶研究進展[J].醫(yī)學綜述，2010，16（13）：1929-1931.

[ 4 ] BOSCOLO-RIZZO P，MOSTO MCD，RAMPAZZO E，et al. Telomeres and telomerase in head and neck squamous cell carcinoma：from pathogenesis to clinical implications[J]. Cancer Metast Rev，2016，35（3）：457-474.

[ 5 ] ARNDT GM，MACKENZIE KL. New prospects for targeting telomerase beyond the telomere[J]. Nat Rev Cancer，2016，16（8）：508-524.

[ 6 ] LIU Z，LI Q，LI K，et al. Telomerase reverse transcriptase promotes epithelial-mesenchymal transition and stem cell-like traits in cancer cells[J]. Oncogene，2013，32（36）：4203-4213.

[ 7 ] AUTEXIER C， LUE NF. The structure and function of telomerase reverse transcriptase[J]. Annu Rev Biochem，2006，75：493-517.

[ 8 ] YANG G，LI J，ZHANG X，et al. Eimeria tenella：cloning and characterization of telomerase reverse transcriptase gene[J]. Exp Parasitol，2010，124（4）：380-385.

[ 9 ] WICK M，ZUBOV D，HAGEN G. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human tleormerase reverse transcriptase（hTERT）[J]. Gene，1999，232（1）：97-106.

[10] CONG TC，LU ZM，LI Y，et al. High efficient generation of replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase by homogeneous recombination in bacteria[J].Chin Med J：Engl，2007，20（18）：1622-1625.

[11] WU X，CHEN J，CAO Y，et al. Antitumor effect of COOH- terminal polypeptide of human TERT is associated with the declined expression of hTERT and NF-κB p65 in Hela cells[J]. Oncol Rep，2015，34（6）：2909-2916.

[12] 李培建，李兵倉. 一種重組腺病毒載體的擴增、純化和病毒滴度檢測方法[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2002，1（1）：52-55.

[13] 孫鵬宇，張艷玲，荊玉明，等. 腺病毒滴度不同測定方法比較[J]. 南方醫(yī)科大學學報，2011，31（2）：234-238.

[14] Burton JD. The MTT assay to evaluate chemosensitivity[J]. Methods Mol Med，2005，110：69-78.

[15] 劉惠芬，李峰，彭東旭，等. 端粒、端粒酶及靶向抗衰老研究[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2017，44（3）：557-559.

[16] PARKS JW，STONE MD. Single-molecule studies of telomeres and telomerase[J]. Annu Rev Biophys，2017，46：357-377.

[17] ZHANG Y，TOH L，LAU P，et al. Human telomerase reverse transcriptase（hTERT）is a novel target of the Wnt/β-catenin pathway in human cancer[J]. J Biol Chem，2012，287（39）：32494-32511.

[18] TANG B，XIE R，QIN Y，et al. Human telomerase reverse transcriptase（hTERT）promotes gastric cancer invasion through cooperating with c-Myc to upregulate heparanase expression[J]. Oncotarget，2016，7（10）：11364-11379.

[19] MUKHERJEE S，F(xiàn)IRPO EJ，WANG Y，et al. Separation of telomerase functions by reverse genetics[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（50）：E1363-E1371.

[20] NITTA E，YAMASHITA M，HOSOKAWA K，et al. Telomerase reverse transcriptase protects ATM-deficient hematopoietic stem cells from ROS-induced apoptosis through a telomere-independent mechanism[J]. Blood，2011，117（16）：4169-4180.

[21] HUNGER RE，KERNLAND LK，MARKOWSKI CJ，et al. Vaccination of patients with cutaneous melanoma with telomerase specific peptides[J]. Cancer Immunol Immunother，2011，60（11）：1553-1564.

[22] KYO S，TAKAKURA M，TAIRA T，et al. Sp1 cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene（hTERT）[J]. Nucleic Acids Res，2000，28（3）：669-677.

[23] BANIK SS，GUO C，SMITH AC，et al. C-terminal regions of the human telomerase catalytic subunit essential for in vivo enzyme activity[J]. Mol Cell Biol，2002，22（17）：6234-6246.

[24] MART?NEZ P，BLASCO MA. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins[J]. Nat Rev Cancer，2011，11（3）：161-176.

[25] HARLEY CB，F(xiàn)UTCHER AB，GREIDER CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts[J]. Nature，1990，345（6274）：458-460.

（收稿日期：2018-01-24 修回日期：2018-08-24）

（編輯：段思怡）