扈曉霞 韓世飛 李晶

摘 要 目的：研究利莫那班對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用及其機(jī)制。方法：取大鼠心肌細(xì)胞接種于6孔板中，密度調(diào)整為2×105 L-1，分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高濃度組（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5組加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大細(xì)胞模型，然后分別加入相應(yīng)濃度的藥物，培養(yǎng)24 h后，觀察并測(cè)量每一個(gè)視野內(nèi)球形細(xì)胞的直徑和細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、一氧化氮（NO）含量、一氧化氮合酶（NOS）活性和Ⅰ型大麻受體（CB1）蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：各組心肌細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞直徑明顯增大，心肌細(xì)胞中Ca2+濃度和CB1蛋白表達(dá)水平均明顯增加，NO含量和NOS活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞直徑明顯縮小，心肌細(xì)胞中Ca2+濃度和CB1蛋白表達(dá)水平均明顯降低，NO含量和NOS活性明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且利莫那班組作用呈濃度依賴性。結(jié)論：利莫那班可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其作用機(jī)制可能與降低Ca2+濃度、下調(diào)CB1蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 利莫那班；血管緊張素Ⅱ；心肌細(xì)胞肥大； Ca2+濃度；Ⅰ型大麻受體

中圖分類號(hào) R915；R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）21-2921-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.10

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of rimonabant on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ（Ang Ⅱ） and its mechanisms. METHODS： Rat cardiomyocytes were incubated in 6 well culture plates with density of 2×105 L-1. They were divided into blank control group， model group， positive control group （losartan10 μmol/L）， rimonabant low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups （0.1，1.0， 5.0 μmol/L）. The latter 5 groups were cultured with 0.1 μmol/L Ang Ⅱ to induce cardiomyocyte hypertrophy model， and then given relevant concentration of drugs. After cultured with 24 h， diameter and number of spherical cells in each field of vision were observed and measured. The Ca2+ concentration， NO content， NOS activity and protein expression of cannabinoid receptor 1（CB1） in cardiomyocyte were determined. RESULTS： There was no statistical significance in the number of cardiomyocyte （P>0.05）. Compared with blank control group， the diameter of cardiomyocytes in model group increased， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were increased significantly； NO content and NOS activity decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， the diameter of cardiomyocytes in positive control group， rimonabant low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups were decreased significantly， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were decreased significantly； NO content and NOS activity increased significantly， with statistical significance （P<0.05）， and the effects of the rimonabant groups were dose-dependent. CONCLUSIONS： Rimonabant can inhibite cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ， the mechanism of which may be associated with the decrease of Ca2+ concentration and protein expression of CB1.

KEYWORDS Rimonabant； AngiotensinⅡ； Cardiomyocyte hypertrophy； Ca2+ concentration； Cannabinoid receptor 1

利莫那班是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)Ⅰ型大麻受體（CB1）抑制劑，利莫那班作為新型減肥藥，2006年在歐盟批準(zhǔn)上市，用于超質(zhì)量或肥胖的成人患者[1]。此外，利莫那班對(duì)調(diào)節(jié)人體胰島素增敏、輔助戒煙、改善患者脂代謝紊亂具有輔助作用[2]。但是由于利莫那班有可能會(huì)增加患者精神方面風(fēng)險(xiǎn)，賽諾菲-安萬(wàn)特（Sanofi-Aventis）公司于2007年6月29日宣布撤消其在美國(guó)的新藥上市申請(qǐng)[3]。近年來，人們不斷研究證實(shí)，生理濃度下內(nèi)源大麻素在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng)，如心血管效應(yīng)、抗炎及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用[4]。有研究者報(bào)道，利莫那班可通過下調(diào)鈣離子（Ca2+）-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、心肌營(yíng)養(yǎng)素1（CT-1）的表達(dá)顯著改善慢性間歇低氧誘發(fā)的心肌肥厚[5-6]。為進(jìn)一步探討CB拮抗對(duì)肥大的原代乳鼠心肌細(xì)胞的影響及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室通過前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，CB1廣泛表達(dá)于人腎臟上皮細(xì)胞HEK293中，參與到HEK293細(xì)胞一系列的生理過程中。但拮抗CB1與心肌細(xì)胞肥大是否同樣存在相關(guān)性，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞建立心肌肥大細(xì)胞模型，研究利莫那班對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用及其機(jī)制，為CB1抑制劑利莫那班預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

qTOWER2.0型熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀 和Chemstudio SA2型多功能成像系統(tǒng)（德國(guó)耶拿公司）；Gene Pulser Xcell型電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；D- 35578 Wetzlar型Leica熒光顯微鏡（德國(guó)Leica Microsystems公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）；SpectraMax M4型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.2 藥品與試劑

利莫那班（批號(hào)：20170506，純度：≥99.8%）和Ang Ⅱ（批號(hào)：HZB0537，純度：>99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氯沙坦鉀膠囊（北京萬(wàn)生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20080015，規(guī)格：每粒50 mg）；小牛血清（批號(hào)：16010-159）和DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：11995-065）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司；SYBR?GREEN PCR Master Mix（美國(guó)Applied Biosystem公司）；CB1基因引物與Ca2+熒光探針（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；生物素化抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)：TA319567）、辣根過氧化物酶（HRP，批號(hào)：HZB0173）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)：A5441）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)：TA309157）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；兔抗鼠CB1一抗（批號(hào)：A-AP19620c）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AK5602）均購(gòu)自重慶卓諾生物技術(shù)有限公司；一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的測(cè)定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml059067）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)，新生1～2 d SD大鼠，50只，♂，體質(zhì)量5.5～6.5 g，來源于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（渝） 20022007，本實(shí)驗(yàn)通過重慶三峽中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意開展相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒別

無菌條件下，取新生1～2 d SD大鼠心室肌，切碎成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶和D-Hanks消化液混懸后，于37 ℃磁力攪拌消化10 min左右，反復(fù)數(shù)次，直至碎片完全消化，吸出上清液，加入含5%小牛血清的培養(yǎng)液終止消化。收集分離包含心肌細(xì)胞的小牛血清DMEM 培養(yǎng)液，梯度貼附法去除心肌周圍細(xì)胞，以 5×105 L-1密度接種于6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，換DMEM 培養(yǎng)基適應(yīng)性培養(yǎng)10 h。免疫組化細(xì)胞學(xué)鑒定心肌細(xì)胞：心肌細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，檢測(cè)時(shí)用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗去除血清和雜質(zhì)，4%多聚甲醛固定15 min；1%牛血清白蛋白封閉30 min；加β-actin一抗（稀釋比例1 ∶ 500），4 ℃過夜；次日加生物素化抗鼠IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 500），37 ℃孵育30 min；加HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素；3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染胞核，系列酒精脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，單細(xì)胞有1～2個(gè)核，最終形成放射排列同心圓；培養(yǎng)24 h后心肌細(xì)胞開始出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)；免疫組化細(xì)胞學(xué)鑒定顯示，胞質(zhì)棕黃色絲狀物為免疫化學(xué)染色陽(yáng)性心肌細(xì)胞，陽(yáng)性率達(dá)98%以上，可滿足進(jìn)一步試驗(yàn)需求。

2.2 分組與給藥

試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高濃度組（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5組加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大細(xì)胞模型，然后改為含相應(yīng)濃度藥物的DMEM 培養(yǎng)液（用二甲基亞砜溶解利莫那班后DMEM稀釋，配制成濃度分別為0.1、1.0、5.0 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)。

2.3 心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)與大小的測(cè)定

心肌細(xì)胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下分組給藥，加藥培養(yǎng)24 h后，用D-Hanks液快速?zèng)_洗長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿3次，加入0.25%胰蛋白酶，消化8 min后，加入10%小牛血清培養(yǎng)液終止消化。顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀，在每一個(gè)視野內(nèi)按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用測(cè)微器測(cè)量心肌細(xì)胞的直徑。

2.4 熒光探針測(cè)定心肌細(xì)胞中Ca2+濃度

心肌細(xì)胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下分組給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，加藥培養(yǎng)24 h后用無菌PBS清洗5次，加入終濃度為3 ?mol/L的Ca2+熒光探針，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，PBS清洗5次，加入培養(yǎng)基，通過熒光顯微鏡4′ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）濾光片下觀察，以340 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，510 nm為吸收波長(zhǎng)，測(cè)定灰度值（F值）。根據(jù)預(yù)先建立的F值與Ca2+濃度之間的相互關(guān)系，計(jì)算Ca2+濃度。

2.5 測(cè)定心肌細(xì)胞中NO 含量和NOS 活性

心肌細(xì)胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下分組給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，加藥培養(yǎng)24 h后，收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定心肌細(xì)胞中NO含量和NOS活性。

2.6 Western blot法測(cè)定心肌細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)

取各組細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入裂解緩沖液100 μL裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞膜，15 000 r/min（離心半徑9 cm）離心20 min，提取上清液蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白濃度。取3～5 ?L蛋白樣本上樣，行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離后轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉2 h。加入一抗兔抗大鼠CB1抗體（稀釋比例1 ∶ 300），4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000），室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的吸光度值（OD值）比值為相對(duì)表達(dá)量，評(píng)價(jià)目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)與大小的變化

顯微鏡下，心肌細(xì)胞均呈球形。各組心肌細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞直徑明顯增大（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞直徑明顯縮?。≒<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，利莫那班低濃度組心肌細(xì)胞直徑明顯增大（P<0.05）。各組心肌細(xì)胞數(shù)量、直徑的測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 心肌細(xì)胞中Ca2+濃度變化

與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度明顯降低（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，利莫那班低濃度組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度明顯升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中Ca2+的熒光染色圖見圖1，Ca2+濃度測(cè)定結(jié)果見表1。

3.3 心肌細(xì)胞中NO含量和NOS活性的變化

與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞中NO含量和NOS 活性明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞中NO含量和NOS 活性明顯增加（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，利莫那班低、中濃度組心肌細(xì)胞中NO含量和NOS 活性明顯降低（P<0.05），利莫那班低、高濃度組心肌細(xì)胞中NO含量和NOS 活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞中NO含量和NOS活性的測(cè)定結(jié)果見表2。

3.4 心肌細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)變化

與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞中CB1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞中CB1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少（P<0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，利莫那班低、中濃度組心肌細(xì)胞中CB1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05） 。各組細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，CB1蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果見表2。

4 討論

我國(guó)心血管疾病患病人數(shù)處于持續(xù)上升階段，心血管疾病病死率居死亡率首位[8]。心肌細(xì)胞肥大是導(dǎo)致心臟疾病和心臟猝死的危險(xiǎn)因素，抑制心肌細(xì)胞肥大備受關(guān)注[9-10]。心肌接受刺激發(fā)生代償，在最初代償期心肌可提高心臟泵血功能，在病因持久作用下，肥大心肌功能失去代償功能而轉(zhuǎn)變?yōu)樾乃?，尋找針?duì)心肌肥大的治療策略一直是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

Ang Ⅱ是公認(rèn)的促心肌肥大因子，本研究采用Ang Ⅱ誘導(dǎo)建立體外心肌肥大細(xì)胞模型，倒置顯微鏡觀察顯示模型組心肌細(xì)胞直徑顯著增加（P<0.05），心肌細(xì)胞腫脹和分界不清的病理改變，提示心肌肥大細(xì)胞模型建立成功，Ang Ⅱ增加模型組心肌細(xì)胞胞膜CA1蛋白表達(dá)，而拮抗CB1可降低胞膜CB1的表達(dá)且隨著利莫那班濃度增加呈濃度依賴性。有研究顯示，CB1活性升高可增加食欲、促進(jìn)攝食等[11-12]，同時(shí)周圍組織能量代謝異常，可引起體質(zhì)量增加，引發(fā)血脂異常，造成心肌細(xì)胞肥大。利莫那班可選擇性抑制CB1，臨床已有研究結(jié)果顯示，拮抗CB1可減輕炎癥、改善代謝、降低血壓、抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[13]。心肌細(xì)胞Ca2+濃度升高是導(dǎo)致心肌肥大的基本信號(hào)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高可激活Ca2+敏感的鈣調(diào)磷酸酶（CaN），活化T細(xì)胞核因子3和鋅指轉(zhuǎn)錄因子，激活多個(gè)相關(guān)基因如心鈉素（ANF）等表達(dá)，促進(jìn)心肌肥大。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，CB1激動(dòng)后也可促進(jìn)胞內(nèi)“鈣池”釋鈣和Ca2+離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M心肌細(xì)胞中Ca2+濃度顯著高于正常對(duì)照組，這一結(jié)果與前人研究[13-14]結(jié)果吻合。利莫那班低、中、高濃度組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度顯著低于模型組，筆者推測(cè)利莫那班拮抗CB1受體可能通過抑制Ca2+釋放和抑制突觸后電位，降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。NO能抑制心肌細(xì)胞分裂和增殖，其激活鳥苷酸環(huán)化酶而抑制L型Ca2+內(nèi)流，最終減弱核轉(zhuǎn)錄因子（NFAT）核移位和轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮抗心肌肥大的作用。本研究結(jié)果顯示，利莫那班能明顯增強(qiáng)NOS的活性（P<0.05）、促進(jìn)NO的釋放（P<0.05），這一作用對(duì)心肌細(xì)胞肥大也具有保護(hù)作用。

近年研究人們發(fā)現(xiàn)花生四稀酸乙醇胺等內(nèi)源性大麻素在糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥因子活化等生理病理過程發(fā)揮重要作用[15-16]，CB1表達(dá)一定程度上可評(píng)價(jià)體內(nèi)大麻系統(tǒng)發(fā)生的變化[17]。本研究結(jié)果證實(shí)，利莫那班能明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞中CB1的表達(dá)、抑制心肌細(xì)胞中Ca2+濃度的升高和增強(qiáng)NOS活性并促進(jìn)NO的釋放，其作用效果與氯沙坦相當(dāng)。有關(guān)CB1拮抗藥對(duì)心肌肥大作用的影響及其細(xì)胞學(xué)機(jī)制目前并不完全清楚，其可能通過拮抗CB1，調(diào)節(jié)食欲、攝食、糖脂代謝、能量代謝、氧化應(yīng)激、血脂異常等病理過程發(fā)揮改善心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)[12，18-19]。

綜上所述，利莫那班對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有抑制作用，呈濃度依賴性，抑制機(jī)制可能與降低Ca2+濃度、下調(diào)CB1蛋白表達(dá)有關(guān)，這一研究結(jié)果提示CB1可作為防治心室肥厚的潛在靶點(diǎn)，具有潛在應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2018-03-19 修回日期：2018-09-18）

（編輯：鄒麗娟）