[摘要]探討油橄欖葉提取物干預(yù)非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用機(jī)制。用高脂飲食9周建立小鼠NAFLD模型，造模第2周起用OLE（1 000 mg/kg）進(jìn)行灌胃治療8周，利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂水平，放射免疫法檢測(cè)炎癥因子指標(biāo)，定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)肝組織中Toll樣受體蛋白4（TLR4）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的水平和蛋白活力。結(jié)果顯示，與模型組比較，OLE干預(yù)后，血清甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）濃度顯著降低；肝臟腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）、TLR4、p38MAPK水平和蛋白顯著降低。OLE可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4-p38MAPK 信號(hào)通路，緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應(yīng)，抑制NAFLD的進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]油橄欖葉提取物；非酒精性脂肪肝；信號(hào)通路；小鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)]R 282.710.5[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]1005-0310（2018）03-0059-05

Abstract： The mechanism of olive leaf extract in the intervention of non-alcoholic fatty liver （NAFLD） is explored. The mouse NAFLD model is established with a high-fat diet for 9 weeks. The OLE （1 000 mg/kg） was used for intragastric administration for 8 weeks from the second week of establishment. The level of blood lipids was measured by an automatic biochemical analyzer， and the inflammatory index was measured by radioimmunoassay. Quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect Toll-like receptor protein 4 （TLR4） and p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK） levels and protein activity in liver tissue. The results show that compared with the model group， serum triglyceride （TG） and free fatty acid （FFA） concentrations were significantly reduced after OLE intervention； liver tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1 （IL-1β）， TLR4， p38MAPK levels and protein were significantly reduced. OLE can alleviate hepatic steatosis and inflammatory factor responses and inhibit the progression of NAFLD by regulating the TLR4-p38MAPK signaling pathway.

Keywords： Olive leaf extract； Nonalcoholic fatty； Signaling pathway； Mouse

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳、環(huán)境、代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，現(xiàn)已成為世界慢性肝病的重要病因，可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌和移植肝復(fù)發(fā)等，但確切發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚[1-2]。多酚、黃酮及橄欖苦苷是油橄欖葉主要活性成分，課題組前期已證實(shí)油橄欖葉提取物在排鉛、海洛因脫毒、預(yù)防糖尿病、抗衰老、減輕缺血再灌注損傷等方面表現(xiàn)出突出的效果[3-12]，具有調(diào)節(jié)肝臟抗氧化能力、改善非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝功能的作用[13]。為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，本研究擬以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，圍繞“Toll 樣受體蛋白4-p38 絲裂原活化蛋白激酶（TLR4-p38MAPK）”信號(hào)通路，觀察油橄欖葉提取物（olive leaf extract，OLE）對(duì)NAFLD的影響，以揭示OLE防治NAFLD的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

油橄欖葉提取物（隴南田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司）；TNF-α、IL-1β試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TLR4、p38MAPK ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、定量PCR試劑（Taka Ra公司），PCR引物由上海涵悅生物科技有限公司設(shè)計(jì)，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

BS-300型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ELx800，美國(guó)BioTek公司）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Beckman美國(guó)TGL-16 M）等；7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀（美國(guó)ABI）；核酸蛋白分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。40只清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（甘）2009-0004），體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立與給藥

健康昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、羅格列酮組和OLE組，每組10只。參照文獻(xiàn)[14]，正常組普通飼料喂養(yǎng)，其他各組每天給高脂飼料（繁殖鼠料54.8%，18.9%豬油，1.3%膽固醇，0.3%膽鹽，11.2%蔗糖，8.7%酪蛋白，1.8%預(yù)混料及3%麥芽糊精）喂養(yǎng)9周，從造模第2周起正常組和模型組灌胃0.1 mL/（10 g·d）生理鹽水，OLE組灌胃OLE（1 000 mg/（kg·d））進(jìn)行治療，連續(xù)給藥8周。

1.2.2血生化指標(biāo)測(cè)定

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均用乙醚麻醉，摘眼球采血以3 000 r/min離心10 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TG和FFA濃度。

1.2.3肝組織中TNF-α、IL-1β含量的檢測(cè)

末次給藥后，迅速取肝，洗凈、冰浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用放射免疫法中的液相競(jìng)爭(zhēng)法和平衡法測(cè)定肝組織中TNF-α、IL-1β的含量，具體方法按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4肝組織中TLR4、p38MAPK蛋白活力的測(cè)定

取100 mg濕肝，加入1 mL PBS緩沖液，冰浴中勻漿（10 000 r/min）20 s，重復(fù)2次，將勻漿液4 ℃（3 600 r/min）離心20 min，取上清液，ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.2.5PCR檢測(cè)肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA 的表達(dá)

取小鼠肝臟，放入2 mL 的離心管，加入1 mL Trizol后用勻漿器反復(fù)研磨，離心（14 000 r/min）10 min，取上清液通過(guò)酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。PCR按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1OLE對(duì)NAFLD小鼠血清中TG、FFA濃度的影響

由圖1可知，模型組小鼠的血清TG、FFA濃度較正常組均顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠血清TG、FFA 濃度較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠血清TG、FFA濃度顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.2OLE對(duì)NAFLD小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，模型組小鼠的肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度較正常組均顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.3OLE對(duì)NAFLD 小鼠肝組織中p38MAPK mRNA表達(dá)的影響

由圖3可知，模型組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達(dá)量較正常組顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達(dá)量較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達(dá)量顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.4OLE對(duì)NAFLD 小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK 蛋白活力的影響

由圖4可知，模型組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK的蛋白活力較正常組顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK的蛋白活力較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK 的蛋白活力顯著低于羅格列酮組（P<0.01）。

3討論

中藥具有活性成分多、作用靶點(diǎn)多、給藥途徑多、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，顯示出良好的臨床療效和安全性。油橄欖葉主要活性成分是多酚、黃酮及橄欖苦苷，既往已證實(shí)油橄欖葉提取物具有良好的防治NAFLD的藥效學(xué)效應(yīng)[13]。TG、FFA含量是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的衡量肝功能的重要指標(biāo)，也是反映脂肪肝的重要指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果表明，OLE對(duì)模型組小鼠顯著升高的TG、FFA含量具有高強(qiáng)度的抑制效應(yīng)。

NAFLD 發(fā)病涉及TLR4-P38MAPK 信號(hào)通路異常[16]，TLR4-P38MAPK通路是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[17]。TLR4是 p38MAPK 上游分子，屬于toll樣受體家族成員，是介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的跨膜蛋白，可通過(guò)識(shí)別相關(guān)配體活化信號(hào)通路中的下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游蛋白激酶，促使效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)、合成并釋放大量的炎癥因子，從而引發(fā)肝損傷[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度，TLR4、P38MAPK的基因表達(dá)水平及蛋白活力均明顯升高，經(jīng)OLE干預(yù)后，肝組織中TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度，TLR4、P38MAPK的表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)，表明OLE 對(duì)其有下調(diào)作用。研究表明，阻斷TLR4-p38MAPK信號(hào)通路能減輕炎癥反應(yīng)，提示TLR4-p38MAPK 信號(hào)通路可能是OLE發(fā)揮抗炎和改善脂質(zhì)代謝紊亂作用靶點(diǎn)。

綜上所述，OLE可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4-p38MAPK 信號(hào)通路，緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應(yīng)，抑制NAFLD的進(jìn)展。該實(shí)驗(yàn)為研發(fā)OLE制劑防治肝損傷相關(guān)疾病提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但有關(guān)其藥理作用機(jī)制和量效關(guān)系等尚需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]杜嬈， 虞勛， 盛小英， 等. 非酒精性脂肪肝的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志， 2009， 11（6）： 133-135.

[2]許嘉， 巴蕾， 吳文倉(cāng)， 等. 脂肪肝的流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 慢性病學(xué)雜志， 2013， 25（7）： 539-542.

[3]Yuan J J， Wang C Z， Ye J Z， et al. Enzymatic hydrolysis of Oleropein form Olea europea （Olive） leaf extract and antioxidant activities[J]. Molecules， 2015， 51（1）： 181-189.

[4]Bulotta S， Corradino R， Celano M， et al. Antioxidant and antigrowth action of peracetylated oleuropein in thyroid cancer cells[J]. J Mol Endocrinol， 2013， 101（10）： 3751-3754.

[5]Kontogianni V G， Gerothanassis I P. Phenolic compounds and antioxidant activity of olive leaf extracts[J]. Nat Prod Res， 2012， 26（2）： 186-189.

[6]Goulas V， Papoti V T， Exarchou V， et al. Contribution of falconoid to the overall radical scavenging activity of olive （olea europaea L.） leaf polar extracts[J]. J Agric Food Chem， 2010， 58（6）： 3303-3308.

[7]Esmaeili-Mahani S， Rezaeezadeh-Roukerd M， Esmaeilpour K， et al. Olive （Olea europaea L.） leaf extract elicits antinociceptive activity， potentiates morphine analgesia and suppresses morphine hyperalgesia in rats[J]. J Ethnopharmacol， 2010， 132（1）： 200-205.

[8]Kaeidi A， Esmaeili-Mahani S， Sheibani V， et al. Olive （Olea europaea L.） leaf extract attenuates early diabetic neuropathic pain through prevention of high glucose-induced apoptosis： in vitro and in vivo studies[J]. J Ethnopharmacol， 2011， 136（1）： 188-196.

[9]Wang Y， Wang S Q， Cui W H， et al. Olive leaf extract inhibits lead poisoning-induced brain injury[J]. Neural Regen Res， 2013， 8（22）： 2021-2029.

[10]王昱， 王勝青， 崔文輝， 等. Olive leaf extract improves cognition and reduces oxidative damage and apoptosis in mice with heroin dependence[J]. 解剖學(xué)報(bào)， 2015， 46（4）： 469-477.

[11]王昱，王勝青， 葉文斌， 等. 橄欖苦苷對(duì)阿爾默茨海默癥小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中國(guó)新藥雜志， 2015， 24 （14）： 91-95.

[12]王昱， 秦序. 橄欖苦苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠衰老相關(guān)生化指標(biāo)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 43（1）： 17-20.

[13]王昱. 油橄欖葉提取物對(duì)非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017，38（2）：96-101.

[14]李寰舟， 王娟紅， 牛聰聰. 復(fù)方銀杏葉制劑對(duì)非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（8）： 1580-1584.

[15]Tomizawa M， Kawanabe Y， Shinozaki F， et al. Triglyceride is strongly associated with nonalcoholic fatty liver disease among markers of hyperlipidemia and diabetes[J]. Academic Journal， 2014， 2（5）： 633-638.

[16]黃凱文， 劉若軒， 謝妙金， 等. 雞骨草提取物對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞TLR4 / p38MAPK信號(hào)通路作用[J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 33（4）： 493-497.

[17]Takahshi Y， Sugimoto K， Inui H， et al. Current pharmacologicaltherapies for nonalcoholic fatty liver disease /nonalcoholic steatohepatitis[J]. World J Gastroenterol， 2015， 21（13）： 3777-3785.

[18]Xue Q， Wang X， Wang P， et al. Role of p38MAPK in apoptosis andautophagy responses to photodynamic therapy with Chlorin e6 [J]. Photodiagn Photodyn， 2015， 12（1）： 84-91.

[19]Ye G， Li C， Xiang X， et al. Bone morphogenetic protein-9 induces PDLSCs osteogenic differentiation through the EPK and p38 signal pathways[J]. Int J Med Sci， 2014， 11（10）： 1065-1072.

（責(zé)任編輯李亞青）